下離心15min，分離上清液，收集沉淀；將硫酸銨以質(zhì)量體積比0. 8:1加入 所得上清液中，靜置30min，在0°C、9000rpm條件下離心30min，收集沉淀；將兩次收集所得 的沉淀合并；
[0025] 4)將步驟3)所得沉淀以質(zhì)量體積比1 :5溶解于pH6.8的0. 015mol/L磷酸二氫 鉀-磷酸氫二鉀緩沖液中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱SephadexG-25頂端， 用本步驟所述磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，用PEG4000 濃縮，得濃縮液；
[0026]5)在步驟4)所得濃縮液中加入NaCl，得到NaCl濃度為0. 5mol/L的溶液，將所得 溶液加入平衡好的鎳離子螯合親和柱頂端，用pH4.5、0. 02mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫， 收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液，用PEG4000濃縮，冷凍干燥，得藍(lán)綠色粉末，即S0D。
[0027] 為了保證制備得到的SOD的活性，本發(fā)明各個(gè)步驟的操作溫度均優(yōu)選為0?4°C。
[0028] 本發(fā)明提供的從蚯蚓中提取的SOD呈藍(lán)色或藍(lán)綠色，屬于含銅和鋅金屬輔基的 S0D類型，即CuZn-SOD。
[0029] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述從蚯蚓中提取的SOD在制備化妝品中的應(yīng)用。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的從蚯蚓中提取的S0D純度高、活性好，并且生產(chǎn)過(guò) 程產(chǎn)率高、安全、環(huán)保，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0032] 本發(fā)明各實(shí)施例中，洗脫液中硫酸銨的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在白色 比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑混合，若出現(xiàn)棕黃色沉淀則表明洗脫液中含有硫酸銨；洗脫 液中蛋白質(zhì)的鑒別方法具體為：取1滴洗脫液，滴在黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水 楊酸混合，若出現(xiàn)白色絮狀沉淀則表明洗脫液中含有蛋白質(zhì)。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] SOD按照以下步驟制備而成：
[0035] 1)將100g蚯蚓浸泡于200ml濃度0. 5%的甲基纖維素溶液中60min，排凈沙土后， 將蚯蚓清洗干凈；
[0036] 2)將步驟1)所得蚯蚓浸泡于300ml冰浴后的pH6. 8、0. 05mol/L磷酸二氫鉀-磷 酸氫二鉀緩沖液中，用高速剪切機(jī)將蚯蚓分散成勻漿液，操作條件為〇°C、3000rpm、10min; 在0°C、3000rpm條件下離心15min，取上清，即得粗酶液370ml;
[0037] 3)將148g硫酸銨溶解于步驟2)所得粗酶液中，靜置30min，在0°C、8000rpm條 件下離心15min，分離上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入155g硫酸銨，靜置30min，在 4°C、9000rpm條件下離心30min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并，得沉淀2. 67g;
[0038] 4)將步驟3)所得沉淀溶解于pH6.8、0. 015mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液 13.35ml中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱S印hadexG-25頂端，用本步驟所述磷 酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，用PEG4000濃縮，得濃縮液 25ml；
[0039] 5)在步驟4)所得濃縮液中加入0. 73gNaCl溶解，將所得溶液加入平衡好的鎳離子 螯合親和柱頂端，用pH4. 5、0. 02mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液， 用PEG4000濃縮得濃縮液，冷凍干燥，得藍(lán)綠色粉末4. 8mg。
[0040] 經(jīng)蛋白凝膠電泳SDS-PAGE檢測(cè)，所得產(chǎn)品分子量與CuZn-SOD型SOD標(biāo)準(zhǔn)品相同， 證明產(chǎn)物為CuZn-SOD型S0D。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] S0D按照以下步驟制備而成：
[0043] 1)將100g蚯蚓浸泡于500ml濃度2%的甲基纖維素溶液中30min，排凈沙土后，將 蚯蚓清洗干凈；
[0044] 2)將步驟1)所得蚯蚓浸泡于500ml冰浴后的pH6. 9、0. 055mol/L磷酸二氫鉀-磷 酸氫二鉀緩沖液中，用高速剪切機(jī)將蚯蚓分散成勻漿液，操作條件為4°C、8000rpm、3min; 在0°C、lOOOrpm條件下離心15min，取上清，即得粗酶液600ml;
[0045] 3)將300g硫酸銨溶解于步驟2)所得粗酶液中，靜置40min，在4°C、8500rpm條 件下離心l〇min，分離上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入405g硫酸銨，靜置40min，在 4°C、9500rpm條件下離心25min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并，得沉淀2. 48g;
[0046] 4)將步驟3)所得沉淀溶解于pH6. 9、0. 02mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液 17.4ml中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱S印hadexG-25頂端，用本步驟所述磷 酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，用PEG4000濃縮，得濃縮液 30ml；
[0047] 5)在步驟4)所得濃縮液中加入1. 32gNaCl溶解，將所得溶液加入平衡好的銅離 子螯合親和柱頂端，用PH4. 9、0. 025mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)的洗脫 液，用PEG4000濃縮得濃縮液，冷凍干燥，得藍(lán)綠色粉末4. 35mg。
[0048] 實(shí)施例3
[0049] S0D按照以下步驟制備而成：
[0050] 1)將100g蚯蚓浸泡于300ml濃度0. 5%的甲基纖維素溶液中90min，排凈沙土后， 將蚯蚓清洗干凈；
[0051] 2)將步驟1)所得蚯蚓浸泡于300ml冰浴后的pH6. 7、0. 045mol/L磷酸二氫鉀-磷 酸氫二鉀緩沖液中，用高速剪切機(jī)將蚯蚓分散成勻漿液，操作條件為4°C、6000rpm、10min; 在0°C、5000rpm條件下離心5min，取上清，即得粗酶液350ml;
[0052] 3)將105g硫酸銨溶解于步驟2)所得粗酶液中，靜置20min，在0°C、7500rpm條 件下離心20min，分離上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入175g硫酸銨，靜置20min，在 4°C、8500rpm條件下離心35min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并，得沉淀2. 55g;
[0053] 4)將步驟3)所得沉淀溶解于pH6. 7、0.Olmol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液 5ml中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱SephadexG-25頂端，用本步驟所述磷酸鹽 緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)且不含硫酸銨的洗脫液，用PEG4000濃縮，得濃縮液5ml;
[0054] 5)在步驟4)所得濃縮液中加入0. 15gNaCl溶解，將所得溶液加入平衡好的鋅離 子螯合親和柱頂端，用PH4. 1、0. 015mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有蛋白質(zhì)的洗脫 液，用PEG4000濃縮得濃縮液，冷凍干燥，得藍(lán)綠色粉末4. 73mg。
[0055] 對(duì)比例1
[0056] 與實(shí)施例1相比，區(qū)別僅在于，所述步驟4)用以下操作代替：將步驟3)所得沉淀 溶解于pH6. 8、0. 015mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液13. 35ml中，置于透析袋中，按 照常規(guī)方法透析去除硫酸銨，每隔5小時(shí)更換一次透析緩沖液，50小時(shí)后，溶液中不含有硫 酸銨，用PEG4000濃縮，得濃縮液。
[0057] 所得產(chǎn)物為藍(lán)綠色粉末3. 88mg。
[0058] 對(duì)比例2
[0059] 與實(shí)施例1相比，區(qū)別僅在于，步驟5)所述檸檬酸緩沖液用pH6. 8、0. 015mol/L磷 酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液代替。
[0060] 所得產(chǎn)物為白色粉末4. 48mg。
[0061] 實(shí)驗(yàn)例：SOD檢測(cè)
[0062] 1、檢測(cè)樣品：實(shí)施例1?3和對(duì)比例1、2所得產(chǎn)物，市售S0D作為標(biāo)