特異性的核酸配對交聯(lián)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及核酸配對交聯(lián)方法。具體地，本發(fā)明涉及由酶催化的序列特異性的核 酸配對交聯(lián)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雙鏈DNA的交聯(lián)會帶來一系列嚴(yán)重后果，它會影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)重時會產(chǎn) 生大量DNA損傷進(jìn)而關(guān)系細(xì)胞的生存，世界上許多實驗室在合成和研究基于DNA受聯(lián)的化 學(xué)分子，以期望開發(fā)出治療癌癥的藥物。目前，有一些簡單可控的化學(xué)交聯(lián)基團(tuán)已經(jīng)用于生 命科學(xué)的研究中，比如invitrogen公司的clickchemistry,NHS-NH2，Thio_Thio等交聯(lián)技 術(shù)。然而，大多數(shù)DNA交聯(lián)試劑都帶有一些比較活躍的化學(xué)基團(tuán)，這些基團(tuán)在發(fā)揮其交聯(lián)性 質(zhì)的同時，也能夠與許多細(xì)胞內(nèi)生物分子反應(yīng)，加上這些分子的使用濃度比較高，它們往往 帶來嚴(yán)重的生物毒性，因而，開發(fā)低毒的交聯(lián)試劑對于臨床應(yīng)用具有非常重大的意義。
[0003] 發(fā)明概述
[0004]本發(fā)明方法的原理如下：苯二酚作為核酸交聯(lián)的活性基團(tuán)，在酪氨酸酶作用下，苯 二酚被氧化為苯二醌繼而與配對的核酸堿基上的氨基或者巰基發(fā)生氧化邁克爾加成反應(yīng)。 苯二酚的反應(yīng)活性并不高，其被酪氨酸酶氧化成活性苯二醌時需要與相應(yīng)反應(yīng)基團(tuán)非常接 近才能反應(yīng)，不配對的游離核酸幾乎不與其發(fā)生交聯(lián)，因而本發(fā)明特別適用于核酸印跡，探 針雜交等生命科學(xué)研究領(lǐng)域。
[0005]本發(fā)明中使用的苯二酚作為核心交聯(lián)基團(tuán)與生物體內(nèi)的兒茶酚以及多巴胺類化 合物具有相似結(jié)構(gòu)，作為還原性酚類是清除體內(nèi)氧自由基的有效物質(zhì)，因而由苯二酚修飾 核酸的毒性很低。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明提供了由酶催化的序列特異性的核酸配對交聯(lián)方法，該方法利用苯二酚與 巰基交聯(lián)應(yīng)用于高效共價連接互補(bǔ)配對的兩條DNA和\或RNA片段，或可以利用苯二酚與 天然堿基上的氨基反應(yīng)應(yīng)用于核酸探針檢測。
[0007] 技術(shù)原理：
[0008] 以DNA為例，如圖1所示，當(dāng)苯二酚修飾DNA與巰基修飾的DNA或未修飾DNA發(fā) 生互補(bǔ)配對后，酪氨酸酶催化苯二酚氧化為苯二醌，處于活性狀態(tài)下的苯二醌容易和附近 的巰基或者氨基反應(yīng)，該化學(xué)反應(yīng)稱氧化邁克爾加成。發(fā)生加成反應(yīng)后互補(bǔ)配對的DNA不 可逆的共價交聯(lián)在一起。苯二醌容易與巰基反應(yīng)，其次是氨基，當(dāng)苯二醌周圍沒有配對DNA 時，其可能被還原為苯二酚或者與自身所在DNA堿基上氨基發(fā)生反應(yīng)。該反應(yīng)中，苯二酚修 飾DNA不能與游離DNA發(fā)生交聯(lián)，故該方法適用于序列特異性DNA檢測。
[0009] 由于該反應(yīng)利用苯二酚活化后的苯二醌與巰基或氨基的反應(yīng)，本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員完全可以確信本發(fā)明可以適用于DNA與DNA之間的交聯(lián)，DNA與RNA之間的交聯(lián)，以及 RNA與RNA之間的交聯(lián)。
[0010] 在一個方面，1.本發(fā)明涉及制備核酸探針的方法，其特征在于將化合物中苯二酚 基團(tuán)連接到目的核酸上。
[0011] 2.根據(jù)上述1的實施方案中，苯二酚基團(tuán)通過酰胺鍵連接到氨基修飾的目的核酸 上。
[0012] 3.根據(jù)上述1-2任一個的實施方案中，使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)將化合物 中的苯二酚通過酰胺鍵連接到氨基修飾的目的核酸上，優(yōu)選地，所述化合物選自由3,4-二 羥基苯乙酸或DL-3,4-二羥基杏仁酸，3,4-二羥基苯甲酸，3- (3,4-二羥苯基）丙酸，3- (3， 5-二羥苯基）-1-丙酸，2,4-二羥基肉桂酸和咖啡酸組成的組。
[0013] 4.根據(jù)上述1-3任一個的實施方案中，所述目的核酸是DNA或RNA。優(yōu)選地，所述 目的核酸是單鏈DNA或單鏈RNA。
[0014] 5.根據(jù)上述2-4上述任一個的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2-(-CH2-)n， n是選自1-20的整數(shù)，優(yōu)選所述氨基修飾是NH2-(_CH2_)n，n是選自3_20的整數(shù)，更優(yōu) 選3-12的整數(shù)。在具體的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2-(-CH2-)3,NH2-(-CH2-)6* NH2_ (_CH2_) 12，優(yōu)選NH2_ (_CH2_) 6。
[0015] 6.根據(jù)上述1-5任一個的實施方案中，所述苯二酚位于目的核酸的3'末端或5' 末端。
[0016] 在另一個方面，7.本發(fā)明涉及交聯(lián)核酸的方法，其包括（1)將苯二酚基團(tuán)連接到 目的核酸上獲得苯二酚修飾核酸；（2)在酪氨酸酶存在下，與苯二酚修飾核酸互補(bǔ)的核酸 或與苯二酚修飾核酸互補(bǔ)的巰基修飾核酸與苯二酚修飾核酸反應(yīng)。
[0017] 8.根據(jù)上述7的方法，其中所述目的核酸進(jìn)行了氨基修飾。
[0018] 9.根據(jù)上述8的實施方案中，苯二酚基團(tuán)通過酰胺鍵連接到氨基修飾的目的核酸 上。
[0019] 10.根據(jù)上述7-9任一個的實施方案中，使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)將化合物 中的苯二酚通過酰胺鍵連接到氨基修飾的目的核酸上，優(yōu)選地，所述化合物選自由3,4-二 羥基苯乙酸，DL-3,4-二羥基杏仁酸，3,4_二羥基苯甲酸，3-(3,4_二羥苯基）丙酸，3-(3， 5-二羥苯基）-1-丙酸，2,4-二羥基肉桂酸和咖啡酸組成的組。
[0020] 11.根據(jù)上述7-10任一個的實施方案中，所述目的核酸是DNA或RNA。優(yōu)選地，所 述目的核酸是單鏈DNA或單鏈RNA。
[0021] 12.根據(jù)上述8-11任一個的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2-(-CH2-)n，n是選 自1-20的整數(shù)，優(yōu)選所述氨基修飾是NH2-(-CH2_)n，n是選自3-20的整數(shù)，更優(yōu)選3-12的整 數(shù)。在具體的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2- (-CH2_) 3,NH2- (-CH2_) 6或NH2- (-CH2_) 12， 優(yōu)選NH2- (_CH2_) 6。
[0022] 13.根據(jù)上述7-12任一個的實施方案中，所述苯二酚位于目的核酸的3'末端或 5,末端。
[0023]14.根據(jù)上述7-13任一個的實施方案中，所述巰基修飾核酸中巰基與核酸的間隔 臂是6個-CH2-基團(tuán)。
[0024] 15.根據(jù)上述7-14任一個的實施方案中，所述巰基位于核酸的5'端或3'端。
[0025] 16.根據(jù)上述7-15任一個的實施方案中，在與苯二酚修飾核酸互補(bǔ)的巰基修飾核 酸與苯二酚修飾核酸反應(yīng)的情形中，另外添加10-100倍于所述巰基修飾核酸使用濃度的 巰基還原劑。優(yōu)選地，所述巰基還原劑選自由二硫蘇糖醇（DTT)，巰基乙醇，半胱氨酸，谷胱 甘肽和苯硫酚組成的組。
[0026] 在另一個方面，17.本發(fā)明涉及制備核酸芯片的方法，包括（1)將苯二酚基團(tuán)連接 到用作探針的目的核酸上；（2)將苯二酚修飾后的目的核酸固定在支持物上。
[0027] 18.根據(jù)上述17的方法，其中所述目的核酸是被氨基修飾的。
[0028] 19.根據(jù)上述17或18的實施方案中，苯二酚基團(tuán)通過酰胺鍵連接到氨基修飾的目 的核酸上。
[0029] 20.根據(jù)上述17-19任一個的實施方案中，使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)將化 合物中的苯二酚通過酰胺鍵連接到氨基修飾的目的核酸上，優(yōu)選地，所述化合物選自由3， 4-二羥基苯乙酸，DL-3,4-二羥基杏仁酸，3,4_二羥基苯甲酸，3-(3,4_二羥苯基）丙酸， 3- (3, 5-二羥苯基）-1-丙酸，2,4-二羥基肉桂酸和咖啡酸組成的組。
[0030] 21.根據(jù)上述17-20任一個的實施方案中，所述目的核酸是DNA或RNA。優(yōu)選地， 所述目的核酸是單鏈DNA或單鏈RNA。
[0031] 22.根據(jù)上述17-21任一個的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2-(-CH2-)n，n是選 自1-20的整數(shù)，優(yōu)選所述氨基修飾是NH2-(-CH2_)n，n是選自3-20的整數(shù)，更優(yōu)選3-12的整 數(shù)。在具體的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2- (-CH2_) 3,NH2- (-CH2_) 6或NH2- (-CH2_) 12， 優(yōu)選NH2- (_CH2_) 6。
[0032] 23.根據(jù)上述17-22任一個的實施方案中，所述苯二酚位于目的核酸的3'末端或 5,末端。
[0033] 在另一個方面，24.本發(fā)明涉及檢測互補(bǔ)核酸的試劑盒，其包含連接苯二酚的檢測 核酸和酪氨酸酶。
[0034] 25.根據(jù)上述24的實施方案中，苯二酚基團(tuán)通過酰胺鍵連接到氨基修飾的檢測核 酸上。
[0035] 26.根據(jù)上述24-25任一個的實施方案中，使用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)通過 酰胺鍵將化合物中的苯二酚連接到氨基修飾的檢測核酸上，優(yōu)選地，所述化合物選自由3， 4- 二羥基苯乙酸，DL-3,4-二羥基杏仁酸，3,4_二羥基苯甲酸，3-(3,4_二羥苯基）丙酸， 3- (3, 5-二羥苯基）-1-丙酸，2,4-二羥基肉桂酸和咖啡酸組成的組。
[0036] 27.根據(jù)上述24-26任一個的實施方案中，所述檢測核酸是DNA或RNA。優(yōu)選地， 所述檢測核酸是單鏈DNA或單鏈RNA。
[0037] 28.根據(jù)上述24-27任一個的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2-(-CH2_)n，n是選 自1-20的整數(shù)，優(yōu)選所述氨基修飾是NH2-(-CH2_)n，n是選自3-20的整數(shù)，更優(yōu)選3-12的整 數(shù)。在具體的實施方案中，所述氨基修飾選自NH2- (-CH2_) 3,NH2- (-CH2_) 6或NH2- (-CH2_) 12， 優(yōu)選NH2- (_CH2_) 6。
[0038] 29.根據(jù)上述24-28任一個的實施方案中，所述苯二酚位于檢測核酸的3'末端或 5,末端。
[0039] 30.根據(jù)上述24-29任一個的實施方案中，當(dāng)所述互補(bǔ)核酸為巰基修飾的核酸時， 所述試劑盒還包含巰基還原劑，所述巰基還原劑選自由二硫蘇糖醇（DTT)，巰基乙醇，半胱 氨酸，谷胱甘肽和苯硫酚組成的組，并且所述巰基還原劑的使用濃度是所述巰基修飾核酸 使用濃度的10-100倍。
[0040] 31.根據(jù)上述24-30任一個的實施方案中，所述巰基修飾核酸中巰基與核酸的間 隔臂是6個-CH2-基團(tuán)。
[0041] 32.根據(jù)上述24-31任一個的實施方案中，所述巰基位于核酸的5'端或3'端。
[0042] 在另一個方面，33.本發(fā)明涉及包含苯二酚的化合物在修飾核酸中的應(yīng)用。優(yōu)選 地，所述核酸是DNA或RNA;更優(yōu)選，單鏈DNA或單鏈RNA。
[0043] 34.根據(jù)上述33的實施方案中，所述化合物選自所述化合物選自由3,4_二羥基苯 乙酸，DL-3,4-二羥基杏仁酸，3,4-二羥基苯甲酸，3-(3,4-二羥苯基）丙酸，3-(