一種轉基因胰島素的合成工藝的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別是涉及一種轉基因胰島素的合成工藝。
【背景技術】
[0002]胰島素是一種蛋白質類激素，體內胰島素是由胰島B細胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多的細胞群，叫做胰島，胰島素是由胰島β細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。胰島素這類活性蛋白多肽和細胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結構異常復雜，體外難以人工合成，所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療，但牛、豬胰島素結構上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個基酸殘基不同，長期服用會引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療，專利申請?zhí)枮镃N201110064735.7公開了一種復方胰島素制劑，所說的制劑為河豚毒素與胰島素經組合后，充分溶于醫(yī)用或食用油而制成的口服油劑，其中:胰島素含量為0.5-10U/ml，河豚毒素含量為0.01-10 μ g/ml，本發(fā)明針對胰島素易產生副作用和給藥方式的弊端，用微量的河豚毒素與胰島素組成復方口服油相制劑，不但避免了每天注射胰島素的麻煩和皮肉之苦，而且能降低或消除胰島素的副作用，但是該胰島素不能夠在短時間內被大量生產，純度低，藥效較差，不易于控制，穩(wěn)定性不好。

【發(fā)明內容】

[0003]為克服現(xiàn)有技術上的不足，本發(fā)明目的是提供一種轉基因胰島素的合成工藝。
[0004]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案如下:
[0005]一種轉基因胰島素的合成工藝，其工藝步驟如下:
[0006](I)提取目的基因:向牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入適量血清，接種培養(yǎng)人體胰島B細胞，控制培養(yǎng)溫度為35°C，PH為7.0，用限制性內切酶獲取胰島B細胞內的產胰島素的核苷酸序列，提取目的基因，備用；
[0007](2)培養(yǎng)工程菌:選用大腸桿菌作為工程菌，用肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種與搖瓶培養(yǎng)基中，于35°C下振搖培養(yǎng)24h，調pH至5.0，而后放入恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C ;
[0008](3)提取質粒:35°C培養(yǎng)平板中挑取一個直徑2?3mm的單菌落，接種到1ml LB培養(yǎng)液35°C劇烈振搖培養(yǎng)16h，取4ml菌液到5ml離心管，8000rpm室溫離心3min，去上清，放于面巾紙上吸干痕液，加350ul RNaseA的溶液，將5ml離心管置于拇指和食指間柔和地反復顛倒數(shù)次，將上清倒入柱狀收集管中，將柱狀管放到一個消過毒的1.5ml離心管中，加65ul滅菌水，室溫放置2min，8000rpm室溫離心3min洗提質粒；
[0009](4)基因重組:運用同種限制性內切酶切割步驟(3)提取的質粒的基因序列，再經過DNA聚合酶將步驟(I)提取的目的基因導入質?；蛑校?br>[0010](5)感受態(tài)細胞的制備:將步驟(2)某一菌落置于一 70°C溫度下培養(yǎng)，而后用劃線法接種細菌于培養(yǎng)皿，做好標記，于35°C培養(yǎng)過夜，第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，35°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日取菌液Iml接種至含有10ml LB培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，350C劇烈震蕩培養(yǎng)約2_3小時，當菌落600nm OD值達到0.4-0.5時，將燒瓶取出放置冰水上10-15分鐘，在無菌條件下把菌液倒入50ml離心管中，4°C，8000g離心10分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上lmin，吸干殘留的培養(yǎng)液。加1ml 0.1M的CaC12到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴30分鐘，4°C，8000g離心10分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上lmin，吸干殘留的培養(yǎng)液，加2ml冰預冷的0.1M的CaC12，重懸浮菌體，每管0.1ml分裝，至4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0011](6)導入載體:將步驟(4)載有重組基因的質粒導入步驟(5)制得的感受態(tài)細胞中，在大腸桿菌細胞施加高壓，以使導入順利進行；
[0012](7)分離純化:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟(6)得到的大腸桿菌，提取標記基因表達的菌落，將其接種到另一培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)；
[0013](8)基因表達:經過分離純化的工程菌置于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制溫度為35°C，從發(fā)酵罐流出液中即可提取，得到胰島素。
[0014]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟(I)中，所述牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入胰島A細胞的分泌液。
[0015]在一個優(yōu)選實例中，所述步驟⑷中，所述基因重組控制溫度為35_40°C。
[0016]有益效果:本發(fā)明通過提取目的基因、培養(yǎng)工程菌、提取質粒、基因重組、感受態(tài)細胞的制備、導入載體、分離純化、基因表達八大步驟完成轉基因胰島素的合成工藝，能夠在短時間內大量生產，產品為基因產物，純度高，藥效好，發(fā)酵化生產，易于控制，穩(wěn)定性好，整個制取過程嚴格控制PH和溫度，并且通過發(fā)酵化生產，致使生產的胰島素穩(wěn)定性好，循環(huán)有效批量生產，在提取質粒的步驟中，反復離心，使質粒的提取更為純凈，為以后的高純度胰島素生產打下基礎，感受態(tài)細胞的制備耗時長，工藝操作復雜保證了感受態(tài)細胞制取的效率，使平板內的細胞轉化率達到90%以上，選用的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基價廉易得，大大降低了生產成本，載體導入中采用電化法，效率高，本工藝使胰島素在短時間內大量生產，極大滿足人們的需求，適于推廣使用。
【具體實施方式】
[0017]為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合【具體實施方式】，進一步闡述本發(fā)明。
[0018]實施例1:
[0019]本實施例的一種轉基因胰島素的合成工藝，其工藝步驟如下:
[0020](I)提取目的基因:向牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入適量血清，接種培養(yǎng)人體胰島B細胞，控制培養(yǎng)溫度為35°C，PH為中性，用限制性內切酶獲取胰島B細胞內的產胰島素的核苷酸序列，提取目的基因，備用；
[0021](2)培養(yǎng)工程菌:選用大腸桿菌作為工程菌，用普通肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種與搖瓶培養(yǎng)基中，于35°C下振搖培養(yǎng)24h，調pH至5.0，而后放入恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C;
[0022](3)提取質粒:35°C培養(yǎng)平板中挑取一個單菌落(直徑2?3mm)，接種到1ml LB培養(yǎng)液35°C劇烈振搖培養(yǎng)16h，取4ml菌液到5ml離心管，8000rpm室溫離心3min，去上清，放于面巾紙上吸干痕液，加350ulRNaseA的溶液，將5ml離心管置于拇指和食指間柔和地反復顛倒數(shù)次，將上清倒入柱狀收集管中，將柱狀管放到一個消過毒的1.5ml離心管中，加65ul滅菌水，室溫放置2min，8000rpm室溫離心3min洗提質粒；
[0023](4)基因重組:運用同種限制性內切酶切割步驟(3)提取的質粒的基因序列，再經過DNA聚合酶將步驟(I)提取的目的基因導入質?；蛑?；
[0024](5)感受態(tài)細胞的制備:將步驟(2)某一菌落置于一 70°C溫度下培養(yǎng)，而后用劃線法接種細菌