一種高產(chǎn)丙氨酸的枯草桿菌工程菌的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，確切地說是一種高產(chǎn)丙氨酸的枯草桿菌工程菌的構(gòu)建方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-丙氨酸是一種非必需脂肪族的非極性氨基酸，但卻是人體血液中含量最高的氨 基酸，丙氨酸在生物體的代謝中有重要的作用，在食品工業(yè)和醫(yī)藥上都具有重要意義。直 到80年代才在日本形成工業(yè)化生產(chǎn)，L-丙氨酸的制備由一開始的蛋白水解提取法、發(fā)酵 法到現(xiàn)在流行的酶法。酶法轉(zhuǎn)化即通過富有L-天冬氨酸-B-脫羧酶活力的微生物（如 pseudomonasdacunhae等）細(xì)胞催化L-天冬氨酸而得到，其中日本多采用固定化細(xì)胞法， 而我國均采用游離完整細(xì)胞法。許多微生物都能夠發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，近年來有文獻(xiàn)報 道，利用基因工程手段構(gòu)建高效生產(chǎn)L-丙氨酸的工程菌，并以葡萄糖為原料生產(chǎn)丙酮酸， 然后微生物將丙酮酸通過丙氨酸脫氫酶發(fā)生還原氨化反應(yīng)或者直接發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生 成L-丙氨酸。發(fā)酵法主要原料葡萄糖成本低，培養(yǎng)基成分簡單，產(chǎn)品收率高。丙氨酸脫氫 酶催化的酶促反應(yīng)如圖2所示。氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)如圖3所示。
[0003] 北井等用溶膠棒桿菌7183在10%葡萄糖，1(2即0 40.1%，1%504*711200.04%，酵母浸 出汁0. 1%，玉米漿0. 4%，尿素1.8%，pH7. 6?7. 8的培養(yǎng)基中，在30°C培養(yǎng)60h，可積累 3%DL-丙氨酸。另外用嗜氨小桿菌的精氨酸氧酸抗性菌株（MAH2-22)，可在加有0.001% ZnS04 *7H20的葡萄糖培養(yǎng)基中積累DL-丙氨酸47mg/ml，如用10%葡萄糖加10%乳酸銨的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，貝1J產(chǎn)量達(dá)60mg/ml。山田分離了一株耐高溫，可在55°C培養(yǎng)，避免污染的凝 結(jié)芽孢桿菌，培養(yǎng)43h，生成DL-丙氨酸達(dá)29. 5g/L。
[0004] 枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)是芽孢桿菌屬的一種，為革蘭氏陽性細(xì)菌，被 FDA認(rèn)為是安全菌株，可以代謝多種糖，能夠合成多種蛋白酶并能把它們分泌到細(xì)胞外。由 于其非致病性、分泌蛋白能力強(qiáng)的特性和良好的發(fā)酵基礎(chǔ)，是目前原核表達(dá)系統(tǒng)中分泌表 達(dá)外源蛋白較理想的宿主。在枯草芽孢桿菌中，葡萄糖通過磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉(zhuǎn)移酶 (PTS)系統(tǒng)被細(xì)胞吸收。在細(xì)胞中，葡萄糖的代謝途徑有：磷酸戊糖途徑（ppp途徑）、糖酵 解途徑（EMP途徑）、TCA循環(huán)和電子傳遞鏈。PPP途徑主要提供NADPH，為細(xì)胞的各種合成 反應(yīng)提供還原劑，如參與脂肪酸和固醇類物質(zhì)的合成。TCA循環(huán)主要提供合成脂類和氨基酸 的前體，如a_酮戊二酸和草酰乙酸分別是合成谷氨酸和天冬氨酸的前體；草酰乙酸先轉(zhuǎn) 變成丙酮酸再合成丙氨酸；許多氨基酸通過草酰乙酸可異生成糖。因此可以利用增加氨基 酸前體的方法，提高氨基酸的產(chǎn)量?？莶菅挎邨U菌代謝途徑如圖4所示。
[0005] 丙氨酸脫氫酶首先在枯草芽孢桿菌中被發(fā)現(xiàn)，說明枯草桿菌本身能生產(chǎn)L-丙氨 酸，能直接滿足食品工業(yè)的安全生產(chǎn)要求，同時產(chǎn)生的L-丙氨酸分泌到胞外相比大腸桿菌 表達(dá)系統(tǒng)更簡化，但是產(chǎn)量偏低。
[0006] 在B.subtilisIBL23中，乳酸和乙酸是丙氨酸發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，導(dǎo)致碳源流向 乳酸個乙酸削弱了流向丙氨酸的量?；诖耍赏ㄟ^敲除乳酸脫氫酶基因（ldh)和乙酸激 酶基因（ackA)，以增加流向丙氨酸的碳源提高丙氨酸的產(chǎn)量，但基因的敲除可能會對菌株 本身的生長造成一定的影響。本研究的主要內(nèi)容就是通過基因敲除技術(shù)敲除B.subtilis IBL23染色體上丙氨酸合成的支路代謝基因ldh基因和ackA基因從而達(dá)到提高L-丙氨酸 產(chǎn)量的目的。然后野生菌和工程菌在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，研究其發(fā)酵特性并通過 HPLC檢測其丙氨酸產(chǎn)量，研究ldh基因的缺失和ackA基因的缺失對丙氨酸產(chǎn)量的影響。并 通過向LB培養(yǎng)基中加入20g/L葡萄糖，探討葡萄糖對丙氨酸產(chǎn)量的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于通過編號為IBL23_ldh的單基因突變的枯草桿菌的菌株構(gòu)建， 和構(gòu)建得到雙基因突變的枯草桿菌菌株，編號為IBL23-ldh/ackA，從而提供一種高產(chǎn)丙氨 酸的枯草桿菌工程菌的構(gòu)建方法。
[0008] 上述目的通過以下方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種高產(chǎn)丙氨酸的枯草桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：
[0010](1)、編號為IBL23-ldh的單基因突變的枯草桿菌的菌株構(gòu)建：
[0011] 以B.subtilisIBL23基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到ldh基因，將ldh基因連 接到T載體pTG19-T上，在大腸桿菌IBL15中轉(zhuǎn)化，藍(lán)白篩選得到重組質(zhì)粒pTG19-T-ldh; 然后以質(zhì)粒pKD3為模板，PCR擴(kuò)增得到氯霉素cm基因，將cm基因用NdeI和EcoRV雙酶 切后連接到重組質(zhì)粒pTG19-T-ldh上，在大腸桿菌IBL15中轉(zhuǎn)化，通過氯霉素抗性篩選得到 打革巴載體pTG19-T_ldh::cm;通過Spizizen法把pTG19-T_ldh::cm在IBL23 中轉(zhuǎn)化，成 功敲除IBL23染色體上的ldh基因，獲得了L-乳酸脫氫酶缺失突變型菌株IBL23-ldh;
[0012] (2)、構(gòu)建得到雙基因突變的枯草桿菌菌株：
[0013] 從L-乳酸脫氫酶缺失突變型菌株IBL23_ldh的基因組中PCR擴(kuò)增得到ackA基因， 連接到T載體PTG19-T上得到重組質(zhì)粒pTG19-T-ackA，然后以質(zhì)粒pKD4為模板，PCR擴(kuò)增得 到卡那霉素kana基因，將kana基因用EagI和Hpal雙酶切后連接到重組質(zhì)粒pTG19-T_ackA 上，在大腸桿菌IBL15中轉(zhuǎn)化，通過卡那霉素抗性篩選得到打祀載體pTG19-T_ackA::kana; 通過Spizizen法把pTG19_T_ackA::kana在IBL23_ldh中轉(zhuǎn)化，成功敲除IBL23_ldh染色 體上的ackA基因，獲得了L-乳酸脫氫酶和乙酸激酶缺失突變型菌株IBL23-ldh/ackA。
[0014]所述的一種高產(chǎn)丙氨酸的枯草桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：（3)研究了 野生型B.subtilis168、單基因突變株IBL23-ldh和雙基因突變株IBL23-ldh/ackA的發(fā)酵 特性，通過多次傳代和抗生素篩選得到了穩(wěn)定；通過顯微鏡發(fā)現(xiàn)三株菌在形態(tài)方面的區(qū)別； 通過HPLC分析三株菌中的丙酮酸產(chǎn)量和丙氨酸產(chǎn)量。
[0015] 所述的一種高產(chǎn)丙氨酸的枯草桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的乳酸 脫氫酶基因和乙酸激酶基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸殘基序列如下：
[0016] a.乳酸脫氫酶基因（ldh)的核苷酸序列如列表中SEQIDNO. 1所示；乳酸脫氫酶 基因（ldh)的編碼的氨基酸殘基序列如列表中SEQIDN0. 2所示；
[0017] b.乙酸激酶基因（ackA)的核苷酸序列如列表中SEQIDNO. 3所示；乙酸激酶基 因（ackA)的編碼的氨基酸殘基序列如列表中SEQIDN0. 4所示。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：
[0019] (1)首次用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)丙氨酸；
[0020] (2)編號為IBL23_ldh的單基因突變的枯草桿菌的菌株，是敲除乳酸脫氫酶基因 (ldh)的微生物菌株；
[0021] (3)編號為IBL23_ldh/ackA的雙基因突變的枯草桿菌菌株，是敲除乙酸激酶基 因（ackA)的微生物菌株。
[0022] (4)首次與野生型B.subtilis168相比，在外源添加葡萄糖條件下，單基因突變 菌株丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到1. 602g/L，比野生型提高8. 21倍，雙基因突變菌株丙氨酸最高產(chǎn)量 3.1048/1，提高15.9倍。
[0023] (5)構(gòu)建得到編號為IBL23Aldh的單基因突變的枯草桿菌菌株和編號為 IBL23AldhAackA的雙基因突變的枯草桿菌菌株。對它們進(jìn)行了應(yīng)用，發(fā)酵檢測其的發(fā)酵 特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，三株菌均為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)發(fā)生顯著變化，短桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)榍?形；菌濃和培養(yǎng)基pH方面無顯著變化；在添加葡萄糖的條件下丙酮酸產(chǎn)量方面，單基因突 變菌株最高提高1.62倍，雙基因突變菌株最高可提高2. 1倍；在添加葡萄糖條件下，單基因 突變菌株丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到1. 602g/L，比野生型提高8. 21倍，雙基因突變菌株丙氨酸最高產(chǎn) 量3. 104g/L，提高15. 9倍。本研究是首次用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)丙氨酸，可用于丙氨酸 的生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0024]圖1為枯草芽孢桿菌代謝簡圖；
[0025] 圖2為丙氨酸脫氫酶催化的酶促反應(yīng)示意圖；
[0026] 圖3為氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)；
[0027] 圖4為枯草芽孢桿菌氨基酸代謝途徑示意圖；
[0028] 圖5為IBL23_ldh的單基因突變的枯草桿菌菌株陽性篩選電泳圖；
[0029] 圖6為IBL23_ldh的單基因突變的枯草