可誘導(dǎo)共表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】可誘導(dǎo)共表達(dá)系統(tǒng)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年8月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/679,751和2012年12 月29日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/747,246的利益，其全部公開通過引用引入本文。
[0003] 序列表的引用
[0004] 本申請(qǐng)包括電子提交的序列表，其通過引用引入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明總體屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)生產(chǎn)的技術(shù)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明屬于 重組蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù)領(lǐng)域。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 生物技術(shù)物質(zhì)的產(chǎn)生是復(fù)雜的過程，在所需的產(chǎn)物是不同基因編碼的分子的組合 (如由兩個(gè)或更多個(gè)不同多肽形成的多聚蛋白質(zhì)）時(shí)更是如此。多個(gè)基因產(chǎn)物的成功共 表達(dá)需要克服多種挑戰(zhàn)，而這由于多于一個(gè)基因產(chǎn)物的同時(shí)表達(dá)而復(fù)雜化。必須克服的問 題包括當(dāng)使用多于一個(gè)類型的載體時(shí)產(chǎn)生相容的表達(dá)載體；獲得正確化學(xué)計(jì)量比的產(chǎn)物； 產(chǎn)生正確折疊的和對(duì)于結(jié)合伴體的處于正確構(gòu)象的基因產(chǎn)物；從細(xì)胞和不希望的蛋白質(zhì)如 未正確折疊的和/或處于不正確構(gòu)象中的蛋白質(zhì)純化出所需的產(chǎn)物；和最小化包涵體的形 成，其作為最大化所需產(chǎn)物的產(chǎn)率的一個(gè)方面。已經(jīng)采取了許多不同的途徑來解決這些挑 戰(zhàn)，但仍有對(duì)于更好的共表達(dá)方法的需要。
[0008] 幾種可誘導(dǎo)的細(xì)菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)（包括含有Iac和ara啟動(dòng)子的質(zhì)粒）已設(shè) 計(jì)用于表達(dá)單個(gè)蛋白質(zhì)。這些系統(tǒng)在難以表達(dá)的蛋白質(zhì)的共表達(dá)中具有有限的用途，因?yàn)?它們不能在野生型大腸桿菌的整個(gè)生長培養(yǎng)物群體內(nèi)同質(zhì)地（homogenously)誘導(dǎo)蛋白質(zhì) (Khlebnikov 和 Keasling, "Effect of IacY expression on homogeneity of induction from the Ptac and Ptrc promoter by natural and synthetic inducers", Biotechnol Prog 2002May-Jun ;18 (3) :672-674)。當(dāng)誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)依賴于誘導(dǎo)劑的存在時(shí)，如在 野生型大腸桿菌Iac和ara系統(tǒng)的情況中，誘導(dǎo)劑的細(xì)胞濃度必須達(dá)到閾值水平以啟動(dòng)轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白的產(chǎn)生，但一旦達(dá)到該閾值，非受控的正反饋環(huán)可以出現(xiàn)，其結(jié)果是細(xì)胞中誘導(dǎo)劑的 高水平和相應(yīng)地來自誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的高水平表達(dá)："全或無"現(xiàn)象。提高生長培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 劑的濃度增加了群體中處于高表達(dá)模式的細(xì)胞的比例。雖然這種類型的系統(tǒng)導(dǎo)致在群體規(guī) 模下蛋白質(zhì)表達(dá)的濃度依賴性誘導(dǎo)，但其對(duì)于需要對(duì)表達(dá)的緊密控制的蛋白質(zhì)（包括為毒 性的、具有不良溶解性或因?yàn)槠渌蛞筇囟舛鹊哪切┑谋磉_(dá)和產(chǎn)生不是最佳的。
[0009] 已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試以通過消除誘導(dǎo)劑依賴性的誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)運(yùn)而在單一啟動(dòng)子表 達(dá)系統(tǒng)中解決"全或無"誘導(dǎo)的現(xiàn)象。一個(gè)實(shí)例是在乳糖滲透酶基因 （lac Yam)中產(chǎn)生無 效突變和使用Iac啟動(dòng)子的可選誘導(dǎo)劑如IPTG (異丙基-硫代-D-半乳糖苷），其可以在 不存在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下在一定程度上穿過細(xì)胞膜（Jensen等，"The use of lizc-type promoter in control analysis"，Eur J Biocheml993Jan 15 ;211 (1-2):181-191)〇 另 一途徑是在阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因缺陷但具有乳糖滲透酶基因中的突變IacY(A117C) (這允許其轉(zhuǎn)運(yùn)阿拉伯糖到細(xì)胞中）的菌株中使用阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子（Morgan-Kiss 等,"Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coli araBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity", Proc Natl Acad Sci U S A 2002May 28;99(ll):7373-7377)。
[0010] 單個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的成分通常是不相容的，排除了其在共表達(dá)系統(tǒng)中的使用， 因?yàn)樗鼈兛赡苁艿讲煌T導(dǎo)劑-啟動(dòng)子系統(tǒng)之間"交互"效應(yīng)的不利影響，或需要相互排斥 的基因組修飾，或經(jīng)歷一般的代謝調(diào)節(jié)。解決Iac和ara誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)之間的"交互" 問題的嘗試包括AraC轉(zhuǎn)錄激活劑的定向進(jìn)化以改善其在IPTG(lac啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑）存 在下誘導(dǎo) araBAD 啟動(dòng)子的能力（Lee 等，"Directed evolution of AraC for improved compatibility of arabinose-and lactose-inducible promoters"，Appl Environ Microbiol 2007S印；73 (18) :5711-5715 ;Epub 2007Jul 20)。但是，基于 ara 和 lac 誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子的表達(dá)載體之間的相容性仍然由于對(duì)于相互排斥的基因組修飾的需要而受到限 制：對(duì)于通過阿拉伯糖對(duì)araBAD啟動(dòng)子的同質(zhì)誘導(dǎo)需要IacY點(diǎn)突變（IacY(A117C))和 對(duì)于通過IPTG對(duì)Iac啟動(dòng)子的同質(zhì)誘導(dǎo)需要無效IacY基因。一般代謝調(diào)節(jié)-例如，碳分 解代謝產(chǎn)物阻遏（CCR)-也可以影響誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的相容性。CCR特征在于當(dāng)存在更優(yōu) 選的化合物時(shí)含碳化合物利用所需的基因的阻遏，如在葡萄糖先于其它糖優(yōu)先利用中看 到的。在ara和prp誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)的情況中，阿拉伯糖的存在降低了丙酸鹽誘導(dǎo)來 自prpB⑶E啟動(dòng)子的表達(dá)的能力，一種據(jù)信涉及CCR的效應(yīng)（Park等，"The mechanism of sugar-mediated catabolite repression of the propionate catabolic genes in Escherichia coli"，Gene2012Aug I ;504(l):116-121，Epub 2012May 3)。顯然存在著對(duì) 于克服這些問題的可誘導(dǎo)共表達(dá)系統(tǒng)的需要。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本發(fā)明提供了能夠受控地誘導(dǎo)各基因產(chǎn)物組分的可誘導(dǎo)共表達(dá)系統(tǒng)。
[0013] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是一種宿主細(xì)胞，其包含兩個(gè)或更多個(gè)類型的表達(dá)構(gòu)建 體，其中各類型的所述表達(dá)構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和編碼基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，所 述多核苷酸序列由所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，其中（1)至少一個(gè)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)其作出 響應(yīng)的誘導(dǎo)劑不是另一個(gè)所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)劑；且至少一個(gè)所述基因產(chǎn)物與另一個(gè) 所述基因產(chǎn)物形成多聚體；或（2)至少一個(gè)所述基因產(chǎn)物選自以下：（a)缺乏信號(hào)肽并形成 至少三個(gè)二硫鍵的多肽；(b)選自利用阿拉伯糖和利用木糖的酶的多肽；和（C)選自木質(zhì) 素降解過氧化物酶的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是包含兩個(gè)或更多個(gè)類型的表達(dá)構(gòu) 建體的宿主細(xì)胞，其中各類型的所述表達(dá)構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和編碼基因產(chǎn)物的多核 苷酸序列，所述多核苷酸序列由所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄；其中各誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不是乳糖誘 導(dǎo)啟動(dòng)子；且其中至少一個(gè)所述基因產(chǎn)物是形成至少兩個(gè)二硫鍵的多肽，或形成至少兩個(gè) 和少于十七個(gè)二硫鍵，或形成至少兩個(gè)和少于十個(gè)二硫鍵，或形成選自兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五 個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)和九個(gè)的多個(gè)二硫鍵的多肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，這一宿主 細(xì)胞是原核細(xì)胞，且在一些情況中，它是大腸桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，宿主 細(xì)胞是真核細(xì)胞，且在一些情況中，它是酵母細(xì)胞，且在進(jìn)一步的情況中，它是釀酒酵母細(xì) 胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含的表達(dá)構(gòu)建體各自包含至少一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子， 其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是L-阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子或丙酸鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，或選自araBAD啟 動(dòng)子、prpBCDE啟動(dòng)子、rhaSR啟動(dòng)子和xlyA啟動(dòng)子，或者其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不是乳糖 誘導(dǎo)啟動(dòng)子。在另外的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含的至少一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼 與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的多核苷酸序列；在一些實(shí)施方式中，編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子 的多核苷酸序列及所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子與其結(jié)合的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在相同的表達(dá)構(gòu)建體中；且在 更進(jìn)一步的情況中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子選自AraC、PrpR、RhaR和XylR ;或特別地為AraC或PrpR。 在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含的至少一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體通過包括將多核苷酸序列插入選 自 pBAD18、pBAD18-Cm、pBAD18-Kan、pBAD24、pBAD28、pBAD30、pBAD33、pPR018、pPR018-Cm、 pPR018-Kan、pPR024、pPR030和pPR033的質(zhì)粒中，或特別地插入pBAD24或pPR033中的步 驟的方法產(chǎn)生。本發(fā)明的其它實(shí)施例包括包含兩個(gè)或更多個(gè)類型的表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì) 胞，其中各類型的所述表達(dá)構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和編碼基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，其 中至少一個(gè)基因產(chǎn)物是多肽，或選自以下：(a)免疫球蛋白重鏈、(b)免疫球蛋白輕鏈和（c) (a)-(b)中任一的片段，或者是免疫球蛋白輕鏈，或者是免疫球蛋白重鏈；或者是英夫利昔 單抗重鏈或輕鏈或者其片段，或者分別在SEQ ID N0:30或SEQ ID N0:31的至少50%或 80%的長度上具有與SEQ ID N0:30或SEQ ID NO:31的至少80%或90%的氨基酸序列同 一性，或者具有SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
[0014] 在本發(fā)明的另外的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞包含兩個(gè)或更多個(gè)類型的表達(dá)構(gòu)建體， 其中各類型的所述表達(dá)構(gòu)建體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和編碼基因產(chǎn)物的多核苷酸序列，所述多 核苷酸序列由所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄；其中至少一個(gè)基因產(chǎn)物是缺乏信號(hào)肽并形成至少三 個(gè)二硫鍵，或者至少三個(gè)和少于十七個(gè)二硫鍵，或者至少