運用比較基因組學(xué)快速鑒定草莓白粉病基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是借助于草莓測序全基因組序列，利用植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信 息學(xué)和候選基因策略等方法快速鑒定草莓白粉病基因，主要涉及到草莓全基因組序列的下 載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術(shù) 科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 草莓白粉病是草莓生產(chǎn)中主要的病害之一，此病由真菌子囊菌亞門的羽衣草單囊 殼菌（Sphaerotheca aphanis)侵染所致，病原菌為專性寄生菌，主要通過帶菌的草莓苗等 繁殖體進行中遠距離傳播；花期染病可導(dǎo)致花瓣變紅，花蕾不開花，果實染病后，幼果不能 正常膨大，果面覆有粉狀物，嚴重影響了草莓的品質(zhì)。草莓白粉病一旦大面積發(fā)生，極難根 除，草莓本身為鮮食漿果，頻繁使用農(nóng)藥勢必會影響到食用的安全。因此，選育抗白粉病又 有優(yōu)良的色、香、味、形等商品經(jīng)濟性狀的品種，已成為草莓育種的重要方向。
[0003] 目前不同的草莓品種對白粉病抗性存在較大差異，利用傳統(tǒng)的育種方法，工作繁 瑣、育種周期長且選擇效率低，不利于快速的選育適合草莓抗病品種。所以人們通常運用現(xiàn) 代的基因克隆技術(shù)，將外源的抗病基因?qū)胄誀顑?yōu)良的草莓品種，從而獲得高抗優(yōu)質(zhì)的草 莓新品種。因此克隆草莓抗白粉病基因并研究其結(jié)構(gòu)及功能特點，對抗病基因的利用具有 重要的意義。
[0004] MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發(fā)現(xiàn)ML0(Mildew resistance locust)基因?qū)Π追鄄】剐允鞘加?937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集 了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.hordei)所有已 知的生理小種都具有高效抗性。進一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大 麥對幾乎所有已知大麥白粉病菌的生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發(fā)現(xiàn)很多 植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等等。 因此挖掘植物中的MLO型抗病基因?qū)χ参锟拱追鄄∮N具有重要的作用。
[0005] 目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉(zhuǎn)座子標簽等方法。但是由于草 莓的基礎(chǔ)研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準確地克隆這些基因。因 此，如何快速鑒定草莓中的MLO型抗病基因?qū)⒊蔀椴葺拱追鄄∮N的重要前提。
[0006] 植物比較基因組學(xué)（Comparative Genomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對 已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學(xué)科。利 用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆其他植物基 因，揭示基因功能和分子機制，闡明物種進化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。本專利所采用的方 法及思路：模式植物擬南芥基因組研究已經(jīng)揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上 的同源性克隆草莓MLO型抗病基因，根據(jù)模式植物擬南芥實驗系統(tǒng)上的優(yōu)越性和已知MLO 型抗病基因的特點，快速"捕捉"草莓抗白粉病基因。本專利介紹了以草莓全基因組序列為 前提，結(jié)合比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和候選基因策略等知識，快速挖掘 白粉病基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過結(jié)合植物比較基因組學(xué)、植物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和 生物信息學(xué)等知識，快速挖掘草莓抗白粉病基因。其結(jié)果一方面可用于草莓白粉病基因緊 密連鎖分子標記的開發(fā)，進行分子標記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據(jù)。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 主要原理：第一個植物抗白粉病基因（MLO)是從大麥中克隆的，研究發(fā)現(xiàn)此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數(shù)NBS(nucleotide-binding site)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實MLO 型抗病基因已經(jīng)成為植物特有的一類抗白粉病基因。進一步發(fā)現(xiàn)，植物MLO類型基因是一 個基因家族；而且對來源于不同物種的MLO基因家族進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。草莓基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經(jīng)測序的草莓全基因組中MLO基因家族和已經(jīng)克隆的MLO白粉病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系以及對于維持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定草莓白粉病基因。
[0011] 主要步驟如下：
[0012] 1)草莓全基因組序列的下載及其MLO型基因的采集
[0013] 首先從草莓測序基因組數(shù)據(jù)庫（http ://www. strawberrygenome. org/)下載草莓 全基因組序列；使用"DNAT00LS"軟件對獲得的草莓全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫， 然后用 Pfam 數(shù)據(jù)庫（蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http :// pfam. janelia. org/search/sequence)中 的隱馬爾可夫模型（HMM)對MLO結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的草莓全基因組氨基酸序列 數(shù)據(jù)庫進行Blastp (E-Value=O. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用已經(jīng) 公布的MLO型基因序列，對草莓基因組數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，獲得候選基因序列。
[0014] 2)草莓MLO型基因家族的鑒定
[0015] 將上述結(jié)果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-Value=LO)進行 分析，去除無 'ML0'結(jié)構(gòu)域的基因序列（圖1)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. 1軟件 提供的ClustalW工具（多序列比對程序）進行多序列比對，去除重復(fù)序列。
[0016] 3)通過植物MLO型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定候選的草莓MLO型白粉病基因
[0017] 由于先前的研究已經(jīng)證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統(tǒng) 發(fā)育樹同一區(qū)組，因此在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和草莓MLO型基因一起聚類分析，以獲得候選的草莓抗白粉 病基因（圖2)。
[0018] 4)草莓白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
[0019] 利用Bi〇XM2. 6軟件將草莓候選的MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的 MLO白粉病基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成Fasta格式的文件，將這些文件導(dǎo)入Bi〇Edit7. 0軟件， 運用此軟件中Clustal軟件進行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區(qū)域 的保守性。從而進一步鑒定草莓候選的白粉病基因（圖3)。
[0020] 本發(fā)明的積極效果：
[0021] 1)縮短了草莓白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規(guī)方 法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本 發(fā)明基于植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)方法快速挖掘草莓白粉病基因，不僅可以 縮短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0022] 2)草莓（Fragaia ananassa)屬于是對薔薇科草莓屬植物，是全世界廣泛種植的 重要水果作物之一。由于草莓遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源多樣性低，因此通過常規(guī)的分子標記 (RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鑒定草莓白粉病基因比較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開 發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標記輔助選 擇，進行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種年限，提高育種效率。
[0023] 3)為闡述草莓抗白粉病分子機制奠定了基礎(chǔ)。草莓抗白粉病基因的鑒定，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)等研究 抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述草莓抗白粉病的作用機理。
【附圖說明】
[0024] 圖1草莓MLO基因的鑒定；
[0025] 本圖顯示的是20個MLO型基因鑒定結(jié)果，每一個基因都含有一個'ML0'保守結(jié)構(gòu) 域。
[0026] 圖2植物MLO基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析及其草莓MLO型白粉病基因的鑒定；
[0027] 擬南芥是植物科學(xué)研究的模式植物，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥的15個MLO型 基因（其中3個基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SlMLO)、大麥白粉病基因 （HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和 草莓MLO型基因聚類分析。共鑒定出3個草莓候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標記的 基因就是候選草莓白粉病基因。
[0028] 圖3草莓MLO型白粉病基因的比對分析；
[0029] 3個草莓白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)進行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區(qū)域的保守型。圖中TM1-TM7表示草莓MLO型白粉病基因的7個轉(zhuǎn)模區(qū)域；黑色圓點表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)；I和II表示對白粉菌侵染 重要的氨基酸區(qū)域。
【具體實施方式】
[0030] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出草莓白粉病基因。具體實施過程如下：
[0031] 1)草莓MLO型基因的采集
[0032] 為了獲得草莓全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構(gòu)建HMM模型，從草莓基因組序列中 收索MLO型基因；其次以不同作物中已經(jīng)發(fā)表的MLO基因序列作為靶序列（來自DFCI數(shù) 據(jù)庫：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912, TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383, TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441，TC281428, TC285118, TC285090 ;來自 GenBank 數(shù)據(jù)庫：AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315, AY029317-AY029319， Z95352, AF369563-AF369565, AF369567, AF3