用于測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性的基于優(yōu)球蛋白的方法
【專利說明】用于測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性的基于優(yōu)球蛋白 的方法
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種用于測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性的方法，以及更特別 地是關(guān)于一種間接酶促方法，用于測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性。
[0002] 發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 去纖維蛋白多核苷酸（Merck Index, 1996, no. 2915)是天然起源的物質(zhì)，其是從 動物器官提取而得，且其是由低分子量的聚脫氧核糖核苷酸鈉鹽組成。去纖維蛋白多核苷 酸已成為許多醫(yī)藥研究的主題，所述研究已推測其可作為抗凝血?jiǎng)┯糜谥委煟绹鴮＠?3, 829, 567)。
[0004] 此外，去纖維蛋白多核苷酸亦已被成功用于治療外周動脈血管疾病、急性腎功能 不全（美國專利號4, 694, 134)或急性心肌缺血（美國專利號第4, 693, 995)。
[0005] 目前，去纖維蛋白多核苷酸正用于進(jìn)行靜脈阻塞疾?。╒OD)的治療與預(yù)防的臨床 試驗(yàn)。
[0006] 如同其他提取而得的生物物質(zhì)，去纖維蛋白多核苷酸也受制于組成的有限變化 性，這對于天然生物聚合物是典型的。此狀況的經(jīng)典例子是肝素，已知其在鏈長、分子量、組 成、硫酸鹽化的程度等方面隨批次的變化性。此結(jié)果是相同重量的去纖維蛋白多核苷酸可 能實(shí)際上從比生物活性的觀點(diǎn)而言是非等同的。
[0007] 由于其固有的生物聚合物本質(zhì)，提取、分離與純化的過程無法本身確保產(chǎn)物的絕 對的再現(xiàn)性。
[0008] 然而，如果控制良好，可能降低此變化性。為達(dá)此目的，已有研究得到用于通過從 器官提取分離去纖維蛋白多核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)化的工業(yè)過程，例如美國專利號4, 985, 552所描 述的。
[0009] 上述過程所得到的產(chǎn)物通過測定一些特定的物理化學(xué)參數(shù)而表征，例如，電泳移 動率、消光系數(shù)、旋光力以及質(zhì)量平均相對分子質(zhì)量。然而，這些參數(shù)基本上取決于去纖維 蛋白多核苷酸的結(jié)構(gòu)，并且無法提供其生物活性的信息。
[0010] 目前如我們所知，已報(bào)導(dǎo)用于評估去纖維蛋白多核苷酸的生物活性的方法僅有 纖維蛋白平板測試法與優(yōu)球蛋白水解時(shí)間凝血彈性圖式記錄（thromboelastographic recording)(Prino G. > Mantovani Μ. > Niada R. 、 Coccheri S. 、 Butti A. 、 Indagini preliminari sull' attivitdifibrinolitica、nell' animale e nell' uomo 與 di una nuova sostanza發(fā)表的 diversi organi animali, Simposio Internazionale:La ricerca scientifica nell' industria farmaceutica,意大利，羅馬，1975 年 10 月 2-4 日一Il Farmaco, Ed. Prat.) (1969),24, 552-561)，以及美國專利號7,338,777公開的以血纖維蛋 白溶酶為基礎(chǔ)的方法，上述皆通過引用并入本案。
[0011] 然而，在上述方法中，優(yōu)球蛋白水解時(shí)間凝血彈性圖式記錄的特征是相當(dāng)大的實(shí) 驗(yàn)復(fù)雜性、不令人滿意的再現(xiàn)性與精準(zhǔn)性，以及，在凝血彈性圖式記錄的一些特定例子中， 反應(yīng)線性受限于非常嚴(yán)格的濃度范圍。
[0012] 關(guān)于血纖維蛋白溶酶為基礎(chǔ)的方法，通常通過體外測試中的多種標(biāo)準(zhǔn)而測定 血纖維蛋白溶酶的酶促活性。最常使用的方法之一是由分光光度法或熒光測定法測定 發(fā)色或發(fā)熒光化合物，所述化合物是通過血纖維蛋白溶酶作用于合適的底物上而釋放 (Haemostasis, (1978)，7, 138-145)。通常使用具有SA1-A2-A3-X 的肽底物，其中八1與 A 2是 主要為非極性的氨基酸，A3是賴氨酸或精氨酸，以及X代表可測量的游離的化合物，例如對 硝基苯胺（PNa)或2-萘胺（NA) (Haemostasis，（1978)，7, 146-149)。除了上述肽底物之外， 已成功使用其他的、較簡單的化合物，例如P-硝基節(jié)基對甲苯磺酰-L-精氨酸（Haemostas is, (1978)，7, 105-108)。
[0013] 該化合物X釋放至孵育基質(zhì)中的速率是與樣品中存在的血纖維蛋白溶酶活性（單 位/毫克）成比例。美國專利號7, 338, 777公開的方法因此是基于上述血纖維蛋白溶酶評 估測試法中的發(fā)現(xiàn)，去纖維蛋白多核苷酸增加化合物X的釋放速率與其濃度成比例。
[0014] 然而，此方法是在TRIS緩沖液進(jìn)行，不需要任何其他的血漿/血清活化物/抑制 物。因此，該程序不會反應(yīng)出生理?xiàng)l件或是恰當(dāng)模擬去纖維蛋白多核苷酸在體內(nèi)的作用機(jī) 制。
[0015] 因此，至今未有真正有效地、精確地且可再現(xiàn)的方法被描述并且驗(yàn)證用于測量去 纖維蛋白多核苷酸的生物活性，而精確地反映出產(chǎn)物在復(fù)雜生物系統(tǒng)（體內(nèi)）中的作用機(jī) 制。。
[0016] 我們已經(jīng)建立簡單與可靠的方法用于測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性，使得 通過提取得到的樣品受到控制，且因而使得以去纖維蛋白多核苷酸為基礎(chǔ)的藥物制備能夠 被標(biāo)準(zhǔn)化。
[0017] 本發(fā)明的方法可測定去纖維蛋白多核苷酸的比生物活性，與參考標(biāo)準(zhǔn)比較，具有 高度的精準(zhǔn)性與正確性。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1是通過以去纖維蛋白多核苷酸（濃度為0-50 μ g/ml，0-100分鐘）活化或非 活化的哺乳動物的優(yōu)球蛋白級分，顯示PNA自底物S-2251的釋放動力學(xué)的曲線圖。
[0020] 圖2是說明關(guān)于去纖維蛋白多核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)品與測試樣品的上升的S形曲線圖。
[0021] 圖3是顯示標(biāo)準(zhǔn)制劑（例如：Sl_Ca，Sl_Cb，Sl_Cc)的"吸光度與時(shí)間的對應(yīng)圖"， 其鑒定合適的線性范圍（例如：從30至35分鐘）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明因此涉及用于測定去纖維蛋白多核苷酸樣品的比生物活性的方法，該方法 包含以下步驟：
[0023] a)使優(yōu)球蛋白及血纖維蛋白溶酶特異性的底物接觸去纖維蛋白多核苷酸，該底物 通過與該血纖維蛋白溶酶反應(yīng)而提供可測量的產(chǎn)物；以及
[0024] b)測量在連續(xù)時(shí)間所形成的產(chǎn)物的量。
[0025] 本發(fā)明是一種間接的體外方法，用于測定去纖維蛋白多核苷酸的活性，其以去纖 維蛋白多核苷酸與優(yōu)球蛋白之間的功能性相互作用為基礎(chǔ)。
[0026] 優(yōu)球蛋白是血清球蛋白的級分，其無法溶于蒸餾水中，但可溶于鹽溶液中。
[0027] 優(yōu)球蛋白包含纖維蛋白原、PAI-1、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑（tPA)、血纖維蛋 白溶酶原、以及少量的α 2-抗血纖維蛋白溶酶和因子VIII。
[0028] 本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)去纖維蛋白多核苷酸催化血纖維蛋白溶酶原水解為血纖維 蛋白溶酶。因此，當(dāng)去纖維蛋白多核苷酸與優(yōu)球蛋白及血纖維蛋白溶酶特異性的底物（例 如式A1-A2-A3-X的肽，如Haemostasis, (1978)，7, 138-149公開的，通過引用并入本文）孵 育時(shí)，該化合物X釋放至孵育基質(zhì)的速率增加與去纖維蛋白多核苷酸本身的濃度成比例。 [0029] 換言之，去纖維蛋白多核苷酸催化優(yōu)球蛋白中所含的血纖維蛋白溶酶原水解為血 纖維蛋白溶酶；所述血纖維蛋白溶酶與血纖維蛋白溶酶特異性的底物，優(yōu)選發(fā)色底物酶促 反應(yīng)，以提供可測量的產(chǎn)物。
[0030] 本發(fā)明的方法因此還包括步驟：c)在去纖維蛋白多核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品與測試樣 品二者的酶促反應(yīng)過程中，測定該可測量的產(chǎn)物的釋放速率；d)數(shù)學(xué)上地及/或圖形上地 關(guān)聯(lián)該釋放速率與所對應(yīng)的去纖維蛋白多核苷酸濃度，以得到該去纖維蛋白多核苷酸的測 試樣品的生物活性。
[0031] 本發(fā)明中用于測定的去纖維蛋白多核苷酸樣