品通常依照已知方法由從器官提取 而制備，所述方法例如在美國專利號4, 985, 552中描述，其于前已述，且亦通過引用并入本 文。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的方法，選擇正常工業(yè)制造的批次的去纖維蛋白多核苷酸作為參考樣 本（標(biāo)準(zhǔn)品），并將其用于制備校正曲線。
[0033] 一般而言，本發(fā)明的方法甚至在污染物存在下提供去纖維蛋白多核苷酸的精準(zhǔn)與 正確測量，所述污染物為例如RNA、肝素、降解的去纖維蛋白多核苷酸（從中已移除嘌呤與 嘧啶的去纖維蛋白多核苷酸）或是乙醇，前提是它們的濃度以重量計通常小于10%，從而 不會損害系統(tǒng)。
[0034] 除了允許測定去纖維蛋白多核苷酸之外，本發(fā)明的方法亦可測定衍生自去纖維蛋 白多核苷酸的其他生物學(xué)上相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)，例如去氨基的去纖維蛋白多核苷酸，或更簡單地， 受到物理化學(xué)條件結(jié)合而變性/降解的去纖維蛋白多核苷酸。
[0035] 本方法的靈敏度足以檢測濃度（測定系統(tǒng)中的最終濃度）小于或等于2. 5 μ g/ml 的去纖維蛋白多核苷酸，并且通常表現(xiàn)良好的關(guān)聯(lián)性，高達(dá)大于或等于1000 μ g/ml的最大 濃度值。
[0036] 所使用的優(yōu)球蛋白通常是任何的哺乳動物優(yōu)球蛋白級分，例如牛、豬、兔或人類的 優(yōu)球蛋白，優(yōu)選人類與牛的優(yōu)球蛋白。
[0037] 然而，雖然優(yōu)球蛋白級分是選擇的酶促系統(tǒng)，使用其他等同酶促系統(tǒng)，例如稀釋的 血漿與血清（使用緩沖液高達(dá)1:10)、人工制成或是分離的血纖維蛋白溶酶原的組合、tPA、 uPA、PAI-1&2與α 2-抗血纖維蛋白溶酶以及化學(xué)與生物相關(guān)且具有相似功能的酶促系統(tǒng) 等，皆落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0038] 在本發(fā)明的方法中，血纖維蛋白溶酶的底物可被理解為任何對于血纖維蛋白溶酶 有特異性的底物，其在此方法條件下，釋放出可檢測的水解產(chǎn)物X。
[0039] 取決于可檢測的基團(tuán)X的本質(zhì)，亦可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的備選檢測系 統(tǒng)。分光光度或熒光測定的檢測系統(tǒng)特別有利，特別是分光光度系統(tǒng)。
[0040] 通常使用的底物是血纖維蛋白溶酶原-血纖維蛋白溶酶測定法特異性的底物。 優(yōu)選使用式A 1-A2-A3-X的肽，其中八1與A2為主要是非極性的氨基酸，A 3是賴氨酸或精氨 酸，以及X代表可測量的基團(tuán)。這些底物的實(shí)例是Val-Leu-Lys-pNa、Val-Phe-Lys-pNa或 pyroGlu-Phe-Lys-pNa，其中分光光度法可檢測的基團(tuán)X是對硝基苯胺（pNA)。其他合適的 底物，例如Val-Gly-Arg-2NA，包含2-萘胺，其可由熒光測定法測量。特別優(yōu)選的底物是化 合物H-D-纈氨酰-L-亮氨酰-L-賴氨酸-P-硝基苯胺（H-D-Val-Leu-Lys-pNA)。
[0041] 用于測定優(yōu)球蛋白級分中的去纖維蛋白多核苷酸活性的具體底物通常是為商業(yè) 上可取得的。
[0042] 本發(fā)明的測定方法是通過將去纖維蛋白多核苷酸樣品置放于特定pH與摩爾濃度 的優(yōu)球蛋白溶液中實(shí)施的。
[0043] 特別地，得自哺乳動物血漿的優(yōu)球蛋白級分是以鹽緩沖液將優(yōu)球蛋白溶解并稀釋 為產(chǎn)生血漿的原始體積而重構(gòu)的（例如：得自10毫升血漿的優(yōu)球蛋白級分以鹽緩沖溶液溶 解并重構(gòu)為10毫升，其PH在7與8之間）。
[0044] 然而，在發(fā)色底物的情況下，通常使用的底物濃度為從0. 3至4mM，優(yōu)選為從2. 5至 3. 5mM，以及有利地為3mM，而在發(fā)熒光底物的情況下，使用濃度為從0. 05至0. 15mM。
[0045] 如同其他酶促方法，本發(fā)明的測定方法對基質(zhì)的pH敏感。
[0046] 事實(shí)上，它通常不能用于極端的pH值，在所述pH值酶促系統(tǒng)會被失活。
[0047] 優(yōu)選在進(jìn)行測量期間的任何時間，基質(zhì)的pH值都不會發(fā)生變化，因此，以選自通 常用于生物測試的那些的緩沖系統(tǒng)重構(gòu)優(yōu)球蛋白級分。合適的緩沖系統(tǒng)，例如可為磷酸鹽 緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或是三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽與氯化鈉（TRIS-NaCl)緩沖液。 優(yōu)選以TRIS-NaCl進(jìn)行優(yōu)球蛋白級分的重構(gòu)。
[0048] 在本發(fā)明的方法中，通常優(yōu)選是將孵育基質(zhì)的pH維持在約7至8的范圍，更優(yōu)選 為約7. 4至7. 6。
[0049] 此外，優(yōu)選地保持緩沖系統(tǒng)的濃度在10至200mM的范圍，優(yōu)選為約50mM。更具體 而言，TRIS-NaCl的濃度應(yīng)為50mM的TRIS與150mM的氯化鈉。
[0050] 在用于測定去纖維蛋白多核苷酸生物活性的本發(fā)明的方法中，去纖維蛋白多核苷 酸樣品溶液直接稀釋于優(yōu)球蛋白級分中，而后加入發(fā)色或發(fā)熒光底物。特別地，為了能夠測 量，優(yōu)選地將去纖維蛋白多核苷酸預(yù)稀釋/溶解于TRIS-NaCl緩沖液中，以得到樣品與標(biāo)準(zhǔn) 品二者的母儲液溶液。通過連續(xù)稀釋，從母儲液溶液稀釋該樣品與該標(biāo)準(zhǔn)品成為定義體積 的優(yōu)球蛋白級分，直到約1至1000 μ g/mL的去纖維蛋白多核苷酸的分析濃度范圍。
[0051] 本發(fā)明的測定方法的重要參數(shù)為溫度。關(guān)于建立參考曲線以及在測量階段，優(yōu)選 地在整個測量過程中，以及對于所有測量的樣品維持相同溫度。為了達(dá)到此目的，優(yōu)選使用 溫控裝置，視需要可進(jìn)行數(shù)組測量，適當(dāng)改變樣品的位置，以確保系統(tǒng)具有最大的熱均質(zhì)。
[0052] -般而言，此測定方法使用的溫度范圍，例如25至40°C，優(yōu)選為35至39°C，甚至 更優(yōu)選為37 °C。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)已經(jīng)加入所有的反應(yīng)試劑時，開始測量通過去纖維蛋白多核苷酸 的作用釋放在基質(zhì)中的化合物X的濃度，并且以預(yù)定的頻率，持續(xù)測量一段預(yù)定的時間，作 為X與檢測系統(tǒng)的化學(xué)本質(zhì)的函數(shù)。
[0054] 類似于其他生物測定方法，本發(fā)明的方法亦提供校正階段與測量階段，所述校正 階段與測量階段在相同的微量板上進(jìn)行，以盡可能減少實(shí)驗(yàn)變量的發(fā)生。
[0055] 該校正階段包括在已知增加的去纖維蛋白多核苷酸（標(biāo)準(zhǔn)品）濃度，獲得與樣品 相關(guān)的吸光度數(shù)據(jù)，那些數(shù)據(jù)的統(tǒng)計再處理以及校正曲線的外推，其表示本發(fā)明的酶促反 應(yīng)速率的增加與優(yōu)球蛋白級分中存在的去纖維蛋白多核苷酸的濃度之間的關(guān)聯(lián)性。在測量 階段中，由于在校正階段得到的該關(guān)聯(lián)性，可在相同條件下所測量和處理的吸光度基礎(chǔ)上， 決定去纖維蛋白多核苷酸樣品的未知生物活性。
[0056] 詳言之，實(shí)驗(yàn)規(guī)程通常提供用于制備數(shù)個樣品，在多種已知濃度的去纖維蛋白多 核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)品與未知。根據(jù)預(yù)定的稀釋因子，通過連續(xù)稀釋母溶液制備去纖維蛋白多核 苷酸樣品
[0057] 在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選制備至少5個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與5個濃度的待測樣品，對于 標(biāo)準(zhǔn)品的每一個濃度以及類似地對于測試樣品的每一個濃度，通常是對母溶液連續(xù)1:2稀 釋，制備至少4個重復(fù)。
[0058] 去纖維蛋白多核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)品與測試樣品濃度通常是0. 1至1000 μ g/ml。
[0059] 該測試樣品的濃度優(yōu)選與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的數(shù)量級相同。
[0060] 根據(jù)上述說明，每一個濃度的測量優(yōu)選是在一個微量板上進(jìn)行，其中每個樣品，分 別是對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品與測試樣品的位置優(yōu)選是交替的。根據(jù)此樣品放置的方案（所述方 案以細(xì)節(jié)說明于實(shí)驗(yàn)部分），對于每一濃度的去纖維蛋白多核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品與測試樣品，每一 次至少測量4個吸光度值。
[0061] 在預(yù)定的時間進(jìn)行上述測量的組，亦即，首先在時間h，即已經(jīng)加入所有的成分且 在本發(fā)明的酶促反應(yīng)開始之前，而后以準(zhǔn)確的間隔，進(jìn)行足夠長的時間以獲取所需要的數(shù) 據(jù)。
[0062] 優(yōu)選地，持續(xù)進(jìn)行吸光度測量至最多90分鐘，每1-10分鐘進(jìn)行讀取。更有利的是 每分鐘進(jìn)行讀取。在這樣的波長進(jìn)行分光吸光值讀取，所述波長取決于在酶促水解反應(yīng)過 程中所釋放的可檢測的基團(tuán)X的本質(zhì)。在X為P-NA的具體例子中，測量405nm處的吸光度。 [0063] 稱為原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)品與未知的去纖維蛋白多核苷酸樣品的吸光度讀數(shù)通常是 直接源自于提供讀取操作的相同裝置，