一種牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種牛廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方 法。
【背景技術(shù)】
[000引 間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells, MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來(lái)源 于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC具有干細(xì)胞的共性，即自我更新、多向分化和歸巢的能 力。在特定的機(jī)體外分化環(huán)境下，能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、屯、臟、肝臟、骨、軟骨、肌腫、脂肪、上 皮等多種組織細(xì)胞。
[0003] MSC由于具有自我更新和多向分化的潛能，成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。大量研究證 實(shí)，MSC可W從骨髓分離得到，但也存在于其他不同組織和臟器，如肌肉、脂肪組織、廝血、廝 帶、胎盤、血管等。
[0004] 廝帶是哺乳類具有的連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，由兩條動(dòng)脈、一條靜脈W及包 裹于它們表面的膠凍狀組織-華通氏膠（Wharton' S jelly)所組成。2003年Romanov等 從廝靜脈內(nèi)皮、廝帶華通氏膠和血管周圍組織中分離獲得了 MSCs。廝帶來(lái)源的MSC經(jīng)過(guò) 原代培養(yǎng)后形成的成纖維細(xì)胞，它們的形態(tài)、表面標(biāo)記及其分化潛能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 炬M-MSC)相似。
[0005] 來(lái)源于廝帶的MSC，由于屬于胚胎外組織，是胎兒分娩后的廢棄物，來(lái)源廣泛、獲得 成功率高、含量高、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、生物性能穩(wěn)定、無(wú)社會(huì)倫理道德限制等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 目前針對(duì)牛廝帶MSC的分離方法尚未建立，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于人廝帶MSC研究得較 多，主要的分離方法是酶消化法跟組織塊貼壁法。酶消化法分離廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法 存在一些缺點(diǎn)，酶消化的過(guò)程需要消耗一定的時(shí)間，延長(zhǎng)了分離的時(shí)間；而且使用膜酶或膠 原酶消化廝帶，也大大增加了分離過(guò)程的成本；再次，酶消化法過(guò)程較為繁瑣，且在分離的 效果上穩(wěn)定性較差。組織塊貼壁法雖然在獲得原代細(xì)胞的時(shí)間上比較長(zhǎng)，但是其操作上比 較簡(jiǎn)單，成本也比較低，因此更加適合推廣與應(yīng)用。另外，分離所得到的原代細(xì)胞一般數(shù)量 較少，需在體外進(jìn)行傳代擴(kuò)增，現(xiàn)有技術(shù)中常見(jiàn)的培養(yǎng)體系就是采用DMEM/F12培養(yǎng)基加上 體積比為10 %的胎牛血清（FB巧進(jìn)行廝帶MSC的體外培養(yǎng)與擴(kuò)增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明技術(shù)W牛廝帶為組織材料，采用了操作較為簡(jiǎn)便的組織塊貼壁法對(duì)牛廝帶 進(jìn)行了 MSC的原代分離，并對(duì)其進(jìn)行了擴(kuò)增培養(yǎng)，成功分離得到了牛廝帶MSC。擴(kuò)增培養(yǎng)體 系在無(wú)血清培養(yǎng)基（廠家；Lonza，商品名：通用Ultra CULTURE無(wú)血清培養(yǎng)基），并添加了 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子巧GF，濃度范圍5~lOng/mL) W及血小板衍生因子（PDGF，濃度范圍5~ lOng/mL)，促進(jìn)了牛廝帶MSC的高效擴(kuò)增。
[000引現(xiàn)有技術(shù)中酶消化法分離廝帶MSC的方法存在一些缺點(diǎn)，酶消化過(guò)程延長(zhǎng)了分離 的時(shí)間；而且使用膜酶或膠原酶消化廝帶，也大大增加了分離過(guò)程的成本；再次，酶消化法 過(guò)程較為繁瑣，且在分離的效果上穩(wěn)定性較差。另外采用DMEM/F12培養(yǎng)基加上體積比為 10%的胎牛血清（FB巧的培養(yǎng)體系，細(xì)胞生長(zhǎng)必須依賴于胎牛血清，培養(yǎng)的細(xì)胞分化或衰 老得較快。
[0009] 本發(fā)明目的通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0010] 一種牛廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0011] (1)獲取胎牛廝帶，獲得牛廝帶組織塊，剪碎，將完全培養(yǎng)基加到組織塊中，吹打均 勻后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中；
[0012] (2)搖晃培養(yǎng)皿使組織塊均勻分布于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期 添加完全培養(yǎng)基；
[0013] (3)當(dāng)細(xì)胞爬出后，棄掉舊培養(yǎng)基及組織塊，用PBS清洗培養(yǎng)皿后，加入完全培養(yǎng) 基繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0014] (4)當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)皿后，加入 含邸TA的膜酶混合液進(jìn)行1~3min，待80%~90%細(xì)胞變圓即加入完全培養(yǎng)基終止消 化，，并將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，獲得牛廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0015] 所述完全培養(yǎng)基為添加了 EGF和PDGF的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中EGF的濃度為5~ lOng/mL，PDGF 的濃度為 5 ~lOng/mL。
[0016] 優(yōu)選，步驟（1)所述完全培養(yǎng)基的加入量是每1cm廝帶添加1ml完全培養(yǎng)基。
[0017] 所述定期添加完全培養(yǎng)基是每隔3-5天添加一次，每次完全培養(yǎng)基的添加量為 3ml。
[0018] 優(yōu)選，所述獲取胎牛廝帶的步驟包括：
[0019] (1)取4月齡帶子宮的胎牛，低溫運(yùn)輸箱中保存，3小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；
[0020] (2)在超凈臺(tái)中從子宮中取出胎牛，用剪刀剪斷廝帶，放入裝有預(yù)冷的75 %己醇 的玻璃平皿中浸泡10s ;
[0021] (3)將廝帶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有預(yù)冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血錯(cuò)夾住廝帶 一端，用平綴擠掉血管中的血液，并清洗廝帶表面血潰；重復(fù)清洗一次獲得胎牛廝帶。
[0022] 優(yōu)選，所述獲得牛廝帶組織是將胎牛廝帶剪成1cm的小段，用組織綴剝掉廝帶外 面的膜，再去除動(dòng)脈和靜脈，把獲得的組織剪至1mm 3大小。
[0023] 所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是5 % CA、37 °C、飽和濕度為95%。
[0024] 優(yōu)選，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為L(zhǎng)onza公司的通用Ultra CULTURE無(wú)血清培養(yǎng)基。
[0025] 步驟（4)所述膜酶混合液中邸TA的濃度為0.0 lg/l，膜酶的濃度為0. 25g/l，濃度 均為質(zhì)量體積比。
[0026] 現(xiàn)有技術(shù)存在缺點(diǎn)的導(dǎo)致原因：
[0027] 1、酶消化是一個(gè)較緩慢的過(guò)程，在操作上也比較繁瑣，消化后還需要經(jīng)過(guò)離屯、收 集與洗漆去掉膜酶或膠原酶，所W處理起來(lái)所需的時(shí)間比較長(zhǎng)。
[002引 2、膜酶或膠原酶是比較貴的生物制劑，所W采用酶消化法相對(duì)組織塊貼壁法，成 本會(huì)大大提局。
[0029] 3、經(jīng)過(guò)酶消化后的細(xì)胞貼壁性較差，導(dǎo)致了分離效果的不穩(wěn)定。
[0030] 4、原有的培養(yǎng)體系中，細(xì)胞的生長(zhǎng)必須依賴于胎牛血清，而且沒(méi)有添加EGF及 PDGF成分，EGF及PDGF可W促進(jìn)該細(xì)胞的增殖，抑制該細(xì)胞的分化。
[0031] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[003引 （1)現(xiàn)有技術(shù)中一般采用酶消化法進(jìn)行廝帶MSC的原代分離，而培養(yǎng)體系是一般 都采用0161/。12培養(yǎng)基加上體積比為10%的胎牛血清（。8巧進(jìn)行15(：的體外培養(yǎng)，本發(fā)明 采用了組織塊貼壁法，操作簡(jiǎn)便，成本也較低，而且得到的MSC純度比較高。
[0033] (2)本發(fā)明采用組織塊貼壁法對(duì)牛廝帶MSC進(jìn)行了原代分離，在無(wú)血清培養(yǎng)基中 加入了 EGF及PDGF進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，成功得到了具有自我更新及分化潛能的牛廝帶MSC。在 培養(yǎng)體系中添加了 EGF及PDGF，不僅促進(jìn)了該細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并抑制了該細(xì)胞在體外培 養(yǎng)的分化。
[0034] 做在組織塊爬出細(xì)胞階段，采用逐步添加培養(yǎng)基的方法，相對(duì)于一次性加入大量 的培養(yǎng)基的方法，該方法可提高組織塊貼壁率，進(jìn)而加快細(xì)胞爬出的速度。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為廝帶MSC細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖；
[0036] 圖2為牛廝帶MSC原代細(xì)胞形態(tài)圖；
[0037] 圖3為牛廝帶MSC P3代細(xì)胞形態(tài)圖；
[0038] 圖4為牛廝帶MSC P3代細(xì)胞流式鑒定圖；
[0039] 圖5為對(duì)比例細(xì)胞形態(tài)的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1牛廝帶MSC的分離及培養(yǎng)
[0041] 1、采集胎牛廝帶
[0042] (1)取4月齡帶子宮的胎牛，低溫運(yùn)輸箱中保存，3小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。
[0043] (2)在超凈臺(tái)中從子宮中取出胎牛，用剪刀剪斷廝帶，放入裝有預(yù)冷的75 %己醇 的玻璃平皿中浸泡10s。
[0044] (3)將廝帶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有預(yù)冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血錯(cuò)夾住廝帶 一端，用平綴擠掉血管中的血液，并清洗廝帶表面血潰。重復(fù)清洗一次。
[0045]