一種Small RNA cDNA文庫的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明涉及一種Small RNA cDNA文庫的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物技術(shù)和生命科學(xué)將成為21世紀(jì)引發(fā)新科技革命的重要推動(dòng)力量，包括我國 在內(nèi)的諸多國家已將其列入優(yōu)先發(fā)展的重點(diǎn)研究領(lǐng)域，而基因測序技術(shù)作為生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展 的核也共性技術(shù)，已成為各發(fā)達(dá)國家競相搶占的科技制高點(diǎn)，而相關(guān)的技術(shù)均被少數(shù)幾家 歐美公司所壟斷且設(shè)備價(jià)格昂貴。
[0003] 基因測序要用基因測序儀和測序試劑，而基因測序儀和試劑盒的生產(chǎn)因?yàn)樯婕坝?機(jī)化學(xué)合成，基因改造，催化酶合成和測序等多方面的技術(shù)，工藝復(fù)雜，質(zhì)量要求高，目前主 要只有H個(gè)美國生產(chǎn)廠家，而一臺(tái)儀器一年的試劑費(fèi)用達(dá)1000多萬元。因?yàn)橄母?，我?很多高價(jià)購置的測序儀都處于閑置和痛疾狀態(tài)。
[0004] 基因測序工作仍然與我們密切相關(guān)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)組僅能告訴我們疾病的分子癥 狀，而基因才是引發(fā)疾病的根本原因。若要進(jìn)行疾病預(yù)測，疾病敏感基因的鑒定就必不可 少。只有綜合運(yùn)用遺傳學(xué)，蛋白組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)才能推動(dòng)個(gè)體化醫(yī)療前進(jìn)。
[0005] 高通量測序技術(shù)，是近幾年出現(xiàn)的一項(xiàng)革命性測序技術(shù)，利用其高通量高覆蓋度 的優(yōu)勢，可W在極短的時(shí)間內(nèi)獲取數(shù)百萬甚至數(shù)十億的序列數(shù)據(jù)信息。目前在基礎(chǔ)科學(xué)研 究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
[0006] 科學(xué)往往是在技術(shù)的競爭中發(fā)展進(jìn)步的，高通量測序技術(shù)的發(fā)展亦是如此，隨著 第H代測序技術(shù)的發(fā)展，個(gè)體化醫(yī)療等諸多生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)問題的解決很大程度上依巧 測序技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用前景非常廣闊，市場非常巨大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種 Small RNA (microRNAs、siRNAs 和 piRNAs) cDNA 文庫 的構(gòu)建方法。
[0008] 本發(fā)明提供的一組DM分子，該組分子由如下（1)- (4)所示的四種分子組成：
[0009] (1) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子；
[0010] (2) SEQ ID No. 2 所示的 DNA 分子；
[0011] (3) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子；
[001 引（4) SEQ ID No. 4 所示的 DNA 分子。
[0013] 一組3'接頭分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該組分子是將上述DNA分子的5'末 端連接一個(gè)rApp，3'末端連接一個(gè)封閉基團(tuán)制成；
[0014] 所述封閉基團(tuán)具體為氨基、2'，3' -雙脫氧胞嚼巧核巧或3'倒置的脫氧腺嘿嶺核 巧。
[0015] 一組反轉(zhuǎn)錄引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該組引物由如下（1)- (4)所示的四種 分子組成：
[0016] (1) SEQ ID No. 5 所示的 DM 分子；
[0017] (2) SEQ ID No. 6 所示的 DM 分子；
[0018] (3) SEQ ID No. 7 所示的 DM 分子；
[0019] (4) SEQ ID No. 8 所示的 DM 分子。
[0020] 5'接頭分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該分子的序列如SEQ ID No. 9所示。
[0021] 上述5'接頭分子中，所述分子的堿基全部進(jìn)行2'甲氧基修飾或硫代修飾。
[0022] 一對引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該對引物由如下（1)和（2)所示的兩種分子 組成：
[0023] (1) SEQ ID No. 11 所示的 DNA 分子；
[0024] SEQ ID No. 11所示的DNA分子中的5' -GTCTCCGACTCAG-3'序列與上述任一所述 的5'接頭分子的部分序列一致；
[00巧](2) SEQ ID No. 12 所示的 DNA 分子；
[0026] SEQ ID No. 12 所示的 DNA 分子中的 5' -TCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' 序列與上述 一組DNA分子或上述3'接頭分子的部分序列互補(bǔ)。
[0027] -種構(gòu)建Small RNA cDNA文庫的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑盒包含 上述DNA分子或上述3'接頭分子、上述反轉(zhuǎn)錄引物、上述任一所述的5'接頭分子和所述的 引物組成。
[0028] 上述試劑盒中，所述試劑盒還包含RNA連接酶反應(yīng)緩沖液、DMS0或陽G、不含核酸 酶的水、截短型T4RNA連接酶2、RNA酶抑制劑、第一鏈反應(yīng)緩沖液、dNTPs、二硫蘇糖醇、反轉(zhuǎn) 錄酶、ATP、T4RNA連接酶1、高保真PCR擴(kuò)增緩沖液、dNTPs和高保真DNA聚合酶。
[0029] 一種分離Small RNA的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟：
[0030] (一）提取總 RNA ;
[003。（二）將總RNA轉(zhuǎn)移至超濾柱中，1200化pm離也15min，得濾液；
[0032] (H)轉(zhuǎn)移濾液至管中，加濾液1/10體積的3M NaAc和3倍體積無水己醇，-2(TC凍 存 30min ;
[003引（四）4°C 12000巧m離也30min，去上清，得沉淀；
[0034] (五）在沉淀中加體積百分含量為80%的己醇水溶液，4°C 1200化pm離也5min，去 上清，風(fēng)干得沉淀；
[0035] (六）重復(fù)步驟證）一次，得沉淀，即為Small RNA。
[0036] -種構(gòu)建Small RNA cDNA文庫的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟：
[0037] (-）從樣品中分離Smal 1 RNA ;
[0038] (二）在Small RNA分子的3'末端連接上述3'接頭分子；
[003引（立）將步驟仁）得到的分子與上述反轉(zhuǎn)錄引物退火，得到退火產(chǎn)物；退火產(chǎn)物中 引物與上述3'接頭分子互補(bǔ)成雙鏈結(jié)構(gòu)；
[0040] (四）將退火產(chǎn)物進(jìn)行cDNA第一鏈的合成；
[0041] (五）在步驟（四）的產(chǎn)物的5'末端連接上述任一所述的5'接頭分子；
[0042] (六)W步驟(五)的產(chǎn)物為模板，W上述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物；
[004引（走）回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中長度為100 +lObp條帶，進(jìn)行純化，得Small RNA cDNA 文庫；
[0044] 所述步驟(一）中分離Small RNA的方法具體為上述分離Small RNA的方法；
[0045] 上述方法中，所述步驟(二）的具體步驟如下：
[0046] (-）將步驟(一）分離的Small RNA、上述3'接頭分子、RNA連接酶反應(yīng)緩沖液、 DMS0或陽G、不含核酸酶的水混合，得體系1 ;將體系1置于95C 30s，立即冰上放置2min， 得反應(yīng)液1 ;
[0047] 所述體系1的體積為13.加1，所述Small RNA在體系1中的質(zhì)量大于等于45ng， 所述3'接頭分子在體系1中的質(zhì)量為2X 1〇41 y mol,所述RNA連接酶反應(yīng)緩沖液的商品名 稱為T4RNA Ligase Reaction Buffer,購自肥B公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為B0216,所述DMS0在體 系1中的體積百分含量為5-20%，或所述PEG在體系1中的體積百分含量為10-50% ;
[004引（二）在反應(yīng)液1中加入截短型T4RNA連接酶2和RNA酶抑制劑，得體系2 ;將體系 2置于22C連接1-2小時(shí)，得到在3'末端連接上述3'接頭分子的Small RNA分子；
[0049] 所述體系2的體積為15ul，所述截短型T4RNA連接酶2在體系2中的酶活為300U， 所述RNA酶抑制劑在體系2中的酶活為20U ;
[0050] 所述截短型T4RNA連接酶2的商品名稱為T4RNA Ligase2, truncated,購自肥B公 司，產(chǎn)品目錄號(hào)為M0242 ;
[0051] 所述化aseOut購自Life Technologies公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為10777-019。
[0052] 上述任一所述的方法中，所述步驟(H)的具體步驟如下：
[0053] 將步驟(二)得到的產(chǎn)物與上述反轉(zhuǎn)錄引物混合，得體系3 ;將體系3置于9(TC 30s， 5(TC 5min，然后25°C放置lOmin，得到退火產(chǎn)物；
[0054] 所述體系3的體積為16ul，所述步驟(二）得到的產(chǎn)物在體系3中的體積為15ul， 所述反轉(zhuǎn)錄引物中各引物的質(zhì)量為5Xl(Ti 2mol。
[00巧]上述任一所述的方法中，所述步驟（四）的具體步驟如下：
[0056] 將退火產(chǎn)物與不含核酸酶的水、RNA酶抑制劑、第一鏈反應(yīng)緩沖液、dNTPs、二硫蘇 糖醇、反轉(zhuǎn)錄酶混合，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。
[0057] 上述任一所述的方法中，所述步驟(五）的具體步驟如下：
[005引將步驟（四）的產(chǎn)物與上述任一所述的5'接頭分子、ATP、T4RNA連接酶1混合，得 體系4 ;將體系4置于2(TC連接1小時(shí)，得連接產(chǎn)物；
[005引所述體系4的體積為20ul，所述步驟（四）的產(chǎn)物在體系4中的體積為16ul，所述 T4RNA連接酶1的酶活為20U，所述ATP在體系4中的濃度為ImM，所述5'接頭分子在體系 4中的濃度為luM ;
[0060] 所述T4RNA連接酶1的商品名稱為T4RNA Ligasel，購自肥B公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 麵0204。
[0061] 上述任一所述的方法中，所述步驟(走）的純化方法具體步驟如下：
[006引將步驟(六）得到產(chǎn)物進(jìn)行PAGE凝膠電泳，切下長度為lOO + lObp的凝膠條帶，用 0. 3M化C1浸泡，將凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠過濾管中，收集濾液；加入1 y L用d地20配制的20mg/ mL糖原W及2-5倍體積的無水己醇，-2(TC放置半小時(shí)，12000巧m離也，棄上清，加入體積 百分含量為80%的己醇水溶液；1200