一種丙型肝炎病毒ires元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎病毒（Ifepatitis C virus, HCV)是黃病毒科的成員，是造成慢性丙型肝 炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。全球范圍內(nèi)大約有2億人感染HCV，感染人口約占全 球人口的2~3%。HCV嚴(yán)重地威脅人類(lèi)健康和影響人類(lèi)生活質(zhì)量，但是我們對(duì)HCV的致病 機(jī)制W及病理發(fā)生過(guò)程還缺乏全面深入的了解，還沒(méi)有研制出對(duì)HCV有效的保護(hù)性疫苗 和治療方法。
[0003] HCV是黃病毒科(Flaviviridae)成員，是直徑約有50皿的球形顆粒。病毒有一 脂質(zhì)包膜，結(jié)合著宿主來(lái)源的脂質(zhì)或免疫球蛋白。包膜內(nèi)部是密度較高的核也顆粒，由核也 蛋白和病毒核酸相結(jié)合構(gòu)成。HCV的基因組是一單股正鏈RNA分子。HCV在被感染宿主體 內(nèi)的主要寄生地是肝臟，其病毒的濃度是外周循環(huán)血中的120倍。HCV有嚴(yán)格的宿主限制 性，迄今已證實(shí)的可感染宿主只有人類(lèi)和黑猩猩。
[0004] 丙型肝炎病毒的基因組約為9600bp左右，包括一個(gè)大的約為9036bp的開(kāi)放閱讀 框（0RF)，和兩側(cè)的非編碼區(qū)。HCV的基因組雖小，但也可W分為許多不同功能的基因功能 區(qū)，根據(jù)蛋白的功能不同，可W將HCV的10種蛋白分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩大類(lèi)。該 些蛋白在HCV生活史、宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)亡和物質(zhì)代謝等過(guò)程中發(fā)揮著各自的重要 作用。
[0005] RNA病毒基因表達(dá)效率的研究結(jié)果顯示，RNA病毒基因表達(dá)主要由兩種翻譯起始 機(jī)制進(jìn)行調(diào)控；（1)依賴(lài)5'端甲基化帽狀結(jié)構(gòu)（GpppmG-)介導(dǎo)核糖體對(duì)病毒基因進(jìn)行 翻譯起始；（2)非依賴(lài)5'端甲基化帽狀結(jié)構(gòu)，而是依賴(lài)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internal ribosomal entry site, IRE巧介導(dǎo)核糖體對(duì)病毒基因進(jìn)行翻譯起始。IRES是一種具有介 導(dǎo)翻譯起始功能的RNA元件，依照IRES結(jié)構(gòu)和功能的差異性，IRES元件被劃分為四大類(lèi)群， 即I型（WEV71為代表)，11型（WFMDV為代表)，111型（WHCV為代表）和IV (W CrPV為 代表)。IRES元件對(duì)病毒基因的高效的翻譯表達(dá)為正鏈RNA病毒在宿主體內(nèi)快速增殖擴(kuò)大 種群規(guī)模具有重要意義，從而為丙型肝炎的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列，該些序列 可W精確地控制丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列對(duì)下游蛋白的表達(dá)。
[0007] 本發(fā)明申請(qǐng)人在對(duì)III型IRES元件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和和生物化學(xué)方面的研究中發(fā) 現(xiàn)，III型與I型和II型IRES元件同樣都具有通過(guò)其自身核巧酸序列所形成的特征性空 間結(jié)構(gòu)來(lái)誘導(dǎo)翻譯起始復(fù)合物的構(gòu)象發(fā)生改變，影響核糖體對(duì)于翻譯起始序列的敏感性識(shí) 別和其下游序列對(duì)核糖體內(nèi)部mRNA結(jié)合裂隙的進(jìn)入、定位和固定，從而加強(qiáng)下游蛋白質(zhì)合 成和表達(dá)，但I(xiàn)RES元件介導(dǎo)核糖體所激活的翻譯起始事件是否也需要遵守核糖體傾向于 選擇具有優(yōu)勢(shì)核巧酸環(huán)境的甲硫氨酸密碼子（AUG)作為真正的翻譯起始密碼子，是本申 請(qǐng)人需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題。
[0008] 本申請(qǐng)人經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列 為： 序列 1 :-3ACCATG+4GTG ; 序列 2 ;-3ACCATG+4TTG ; 序列 3 :-3ACCATG+4CTG ; 序列 4 ;-3ACCATG+4ATG ; 序列 5 ;-3TCCATG+4GTG ; 序列 6 ;-3TCCATG+4CTG ; 序列 7 ;-3TCCATG+4TTG ; 序列 8 ;-3TCCATG+4ATG ; 序列 9 ;-3CCCATG+4GTG ; 序列 10 ;-3CCCATG+4ATG ; 序列 11 ;-3CCCATG+4TTG ; 序列 12 ;-3CCCATG+4CTG ; 序列 13 ;-3GCCATG+4GTG ; 序列 14 ;-3GCCATG+4CTG ; 序列 15 ;-3GCCATG+4TTG ; 序列 16 ;-3GCCATG+4ATG。
[0009] 本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)上述丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列能夠調(diào)控 下游序列的蛋白表達(dá)。
[0010] 本申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)當(dāng)丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列 為-3ACCATG+4GTG時(shí)，下游序列蛋白表達(dá)量最大。
[0011] 本申請(qǐng)人通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將翻譯起始序列區(qū)的+4位核巧酸分別替換為四種不 同的核巧酸。將含有同種IRES元件而翻譯起始序列區(qū)+4位不同的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入CH0細(xì)胞 進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)流式細(xì)胞儀將表達(dá)EGFP蛋白的發(fā)光細(xì)胞進(jìn)行分選并計(jì)數(shù)。而后，利用 蛋白質(zhì)印記技術(shù)，將篩選出的等量CH0細(xì)胞進(jìn)行CAT表達(dá)產(chǎn)物和EGFP表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，通 過(guò)灰度計(jì)算測(cè)定IRES元件介導(dǎo)核糖體對(duì)翻譯起始區(qū)+4位和-3位特定核巧酸識(shí)別敏感性 差異而導(dǎo)致IRES元件下游EGFP基因表達(dá)水平的差異性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到：當(dāng)翻譯起始區(qū)的序 列為-3ACCATG+4GTG時(shí)，下游EGFP基因的表達(dá)效率是所有16中翻譯起始序列中最高的。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為含有HCV IRES元件的雙報(bào)告表達(dá)載體構(gòu)建示意圖，從左至右依次為kozak序列 (ACC ATG G,該是一個(gè)可W明顯提局真核細(xì)胞基因表達(dá)的翻譯起始序列），CAT報(bào)告基因， IRES元件、翻譯起始序列、EGFG報(bào)告基因； 圖2為CAT和EGFP蛋白編碼基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖； 圖3為16種含有HCV IRES元件的雙報(bào)告基因表達(dá)載體中目的基因的雙酶切鑒定結(jié)果， 其中，M表示核酸Marker ;序號(hào)1-序號(hào)16為含有HCV IRES元件的雙報(bào)告基因的真核表達(dá) 質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果； 圖4為16種含有HCV IRES元件的雙報(bào)告基因特定翻譯起始區(qū)-3位和+4位突變測(cè)序 圖譜； 圖5為16種含有HCV IRES元件的雙報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中表達(dá)CAT蛋白的 蛋白質(zhì)印記結(jié)果； 圖6為16種含有HCV IRES元件的雙報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中表達(dá)EGFP蛋白 的蛋白質(zhì)印記結(jié)果； 圖7為16種翻譯起始序列在HCV IRES元件的介導(dǎo)下對(duì)EGFP基因表達(dá)水平的影響效 果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。
[0014] 氯霉素己醜轉(zhuǎn)移酶基因（CAT)購(gòu)自；蘇州金唯智生物科技有限公司； 增強(qiáng)型綠色英光蛋白巧GFP)購(gòu)自：蘇州金唯智生物科技有限公司； 實(shí)施例1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列，其特征在于：所述特定翻 譯起始序列為： 序列 I :-3ACCATG+4GTG ; 序列 2 :-3ACCATG+4TTG ; 序列 3 :-3ACCATG+4CTG ; 序列 4 :-3ACCATG+4ATG ; 序列 5 :-3TCCATG+4GTG ; 序列 6 :-3TCCATG+4CTG ; 序列 7 :-3TCCATG+4TTG ; 序列 8 :-3TCCATG+4ATG ; 序列 9 :-3CCCATG+4GTG ; 序列 10 :-3CCCATG+4ATG ; 序列 11 :-3CCCATG+4TTG ; 序列 12 :-3CCCATG+4CTG ; 序列 13 :-3GCCATG+4GTG ; 序列 14 :-3GCCATG+4CTG ; 序列 15 :-3GCCATG+4TTG ; 序列 16 :-3GCCATG+4ATG。
2. 權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列在對(duì)下游序 列蛋白表達(dá)調(diào)控中的作用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的作用，其特征在于：當(dāng)丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定 翻譯起始序列為-3ACCATG+4GTG時(shí)，下游序列蛋白表達(dá)量最大。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列，本發(fā)明還提供上述丙型肝炎病毒IRES元件所對(duì)應(yīng)的特定翻譯起始序列在對(duì)下游序列蛋白表達(dá)調(diào)控中的作用。IRES元件介導(dǎo)核糖體對(duì)翻譯起始區(qū)+4位和-3位特定核苷酸識(shí)別敏感性差異而導(dǎo)致IRES元件下游EGFP基因表達(dá)水平的差異。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到，當(dāng)翻譯起始區(qū)的序列為-3ACCATG+4GTG時(shí)，下游EGFP基因的表達(dá)效率是所有16中翻譯起始序列中最高的。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12N15-63
【公開(kāi)號(hào)】CN104630212
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410689438
【發(fā)明人】劉永生, 周建華, 李學(xué)瑞, 丁耀忠
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2014年11月26日