改進的同型半胱氨酸檢測試劑及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及改進的同型半脫氨酸檢測試劑及方法，尤其涉及利用酶催化反應(yīng)、酶 循環(huán)擴增法、酶比色法測定同型半脫氨酸的方法及試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 同型半脫氨酸化cy)為含琉基氨基酸，是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)過程中的一個代謝中 間產(chǎn)物。血液中總Hey濃度的病理性升高會導(dǎo)致高同型半脫氨酸血癥。而高同型半脫氨酸 血癥與作為人類第一殺手的動脈粥樣硬化、高血壓、也肌梗死等多種也血管疾病的發(fā)生有 密切關(guān)系，是也血管疾病的一個新的獨立和重要的危險因素。同型半脫氨酸的檢測已作為 臨床冠也病的一個獨立風(fēng)險因子，并且其病理性偏高是引起動脈硬化最終導(dǎo)致也臟病和中 風(fēng)的罪魁禍?zhǔn)住?br>[0003] 目前國內(nèi)外已經(jīng)把同型半脫氨酸作為也血管疾病的一個檢測指標(biāo)。如果能給予病 人及時的診斷和預(yù)測，進而采取相應(yīng)措施，僅此一項每年可使數(shù)千萬人幸免于也肌梗塞或 腦血管病，因此對同型半脫氨酸的提前診斷和預(yù)測就具有極其重要的意義。
[0004] 現(xiàn)在國內(nèi)外有多種同型半脫氨酸化cy)檢測方法，包括HPLC(高效液相色譜）、英 光偏振法、酶聯(lián)免疫吸附分析巧LISA)、裂解酶法、循環(huán)酶法等。高效液相（HPLC)方法靈敏 度高，但儀器昂貴、操作非常復(fù)雜，不易于自動化操作；英光偏振免疫檢測（FPIA)方法靈敏 度高，檢測速度快，但價格昂貴，故短時間內(nèi)不易普及；酶免疫分析法涉及到人工操作等，容 易產(chǎn)生誤差；裂解酶法具有穩(wěn)定性差及使用前需要新鮮配制的缺點，在使用上具有很大不 便。當(dāng)前國內(nèi)外流行的Hey檢測方法是Hey循環(huán)酶法檢測試劑盒。該類試劑盒因為具備高 通量、自動化、快速、準(zhǔn)確、靈敏、不涉及人為操作、能直接用于生化分析儀等優(yōu)點，而受到廣 泛歡迎?，F(xiàn)有技術(shù)的Hey循環(huán)酶法檢測試劑盒有兩種：一種為甲基轉(zhuǎn)移酶、水解酶的循環(huán)酶 法；另一種為脫硫離循環(huán)酶法。脫硫離循環(huán)酶法易受人體內(nèi)源脫硫離干擾，而甲基轉(zhuǎn)移酶、 水解酶循環(huán)酶法因為不受人體內(nèi)源的脫硫離干擾，測值準(zhǔn)確，而具有最大的市場占有率，并 最為流行。但現(xiàn)有的甲基轉(zhuǎn)移酶、水解酶循環(huán)酶法依然存在穩(wěn)定性差的缺點，靈敏度也需要 進一步提高。因此，本領(lǐng)域依然存在對穩(wěn)定性強、靈敏度高的甲基轉(zhuǎn)移酶、水解酶循環(huán)酶法 及試劑盒的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一方面涉及一種檢測樣品中同型半脫氨酸含量的檢測試劑，其由試劑 1和試劑2組成，其中試劑1包含下述成分：還原劑，S腺巧甲硫氨酸，pH 8. 0~10. 0的緩 沖液1，邸TA二軸鹽，檢測氨的試劑一部分，乳酸脫氨酶，試劑2包含下述成分：同型半脫氨 酸甲基轉(zhuǎn)移酶，腺巧同型半脫氨酸酶，腺巧脫氨酶（ADA)，穩(wěn)定劑，pH 7. 5~8. 5的緩沖液2， 硫酸鎮(zhèn)，檢測氨的試劑的剩余部分。
[0006] 在一些實施方案中，同型半脫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的用量為0. 5~80KU/1，優(yōu)選地， 1-60KU/1，更優(yōu)選地，5-40KU/1，更優(yōu)選地，10-30KU/1，最優(yōu)選地，20KU/1，和/或腺巧同型 半脫氨酸酶的用量為0. 5~50KU/1，優(yōu)選地，1-40KU/1，更優(yōu)選地，10-30KU/1，最優(yōu)選地， 20KU/L，和/或ADA的用量為0. 1~150KU/L，優(yōu)選地，0. 5~100KU/L，更優(yōu)選地，1~50KU/ L更優(yōu)選地，2~20KU/1，最優(yōu)選地，5KU/1，和/或乳酸脫氨酶的用量為0. 5~20KU/1，優(yōu)選 地，1~10KU/1，更優(yōu)選地，1~5KU/1，最優(yōu)選地，2KU/1，并且其中，腺巧同型半脫氨酸酶的 用量大于同型半脫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的用量，且ADA的用量相對于反應(yīng)體系是過量的。
[0007] 在一些實施方案中，S腺巧甲硫氨酸為商業(yè)可獲得的產(chǎn)品或利用ATP、蛋氨酸、蛋 氨酸轉(zhuǎn)腺巧酶的循環(huán)酶反應(yīng)生成，其中ATP和蛋氨酸位于試劑1，蛋氨酸轉(zhuǎn)腺巧酶位于試劑 2 ;優(yōu)選地，ATP的濃度為0. 5mM~80mM,更優(yōu)選地，1~60mM,更優(yōu)選地，5-30mM,更優(yōu)選地， 8-15mM，最優(yōu)選地，lOmM ;優(yōu)選地，蛋氨酸的濃度為0. 5~80mM，更優(yōu)選地，1~40mM，更優(yōu) 選地，2-20mM，更優(yōu)選地，3-lOmM，最優(yōu)選地，5mM ;優(yōu)選地，蛋氨酸轉(zhuǎn)腺巧酶的用量為0. 1~ 100KU/1，更優(yōu)選地，1~50KU/1，更優(yōu)選地，2~30KU/1，更優(yōu)選地，3~10KU/1，最優(yōu)選地， 5KU/1，并且其中，ATP大于蛋氨酸的量，優(yōu)選地，蛋氨酸轉(zhuǎn)腺巧酶的用量大于同型半脫氨酸 甲基轉(zhuǎn)移酶的用量。
[0008] 在一些實施方案中，還原劑是含硫還原劑或H -(駿己基）磯化氨鹽酸鹽（TCE巧， 優(yōu)選地，含硫還原劑為二硫蘇糖醇值TT)或琉基己醇，優(yōu)選地，DTT的濃度為1. 0~9mM，更 優(yōu)選地，1. 2~7mM,更優(yōu)選地，1. 5~3mM,最優(yōu)選地，1. 5mM。
[0009] 在一些實施方案中，試劑1中檢測氨的試劑一部分為還原型輔酶和a-麗戊二 酸，優(yōu)選地，還原型輔酶選自NADH、NADPH、thio-NADH、thio-NADPH，更優(yōu)選地，還原型輔酶 為NADH，試劑2中檢測氨的試劑的剩余部分為谷氨酸脫氨酶，優(yōu)選地，還原型輔酶的濃度為 0. 3~0. 6mM，更優(yōu)選地，0. 4~0. 5mM，最優(yōu)選地，0. 4mM ;優(yōu)選地，a -麗戊二酸的濃度為1~ 20mM，優(yōu)選地，2~15mM，更優(yōu)選地，5~lOmM，最優(yōu)選地，8mM ;優(yōu)選地，谷氨酸脫氨酶的用量 為1~50KU/1，優(yōu)選地，5-40KU/L，更優(yōu)選地，10-30KU/L，最優(yōu)選地，25KU/L。
[0010] 在一些實施方案中，試劑2的穩(wěn)定劑選自非離子型表面活性劑物質(zhì)、醇類物質(zhì)、糖 類物質(zhì)、鹽類物質(zhì)、氨基酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，優(yōu)選地，試劑2的穩(wěn)定劑選自甘油、海藻糖、甘 露醇、BSA，更優(yōu)選地，試劑2的穩(wěn)定劑是甘油，優(yōu)選地，甘油的濃度為25 %~45%，更優(yōu)選 地，28 %~35%，最優(yōu)選地，30 %。
[0011] 在一些實施方案中，緩沖液1和緩沖液2獨立地選自Tris緩沖液、PBS緩沖液、碳 酸鹽緩沖液，優(yōu)選地，緩沖液1和緩沖液2的濃度為5~500mM，優(yōu)選地，10~200mM，更優(yōu)選 地，20~lOOmM，更優(yōu)選地，30~80mM ;優(yōu)選地，緩沖液1和緩沖液2均為50mM的Tris緩沖 液且其中緩沖液1的抑為9. 0,緩沖液2的抑為8. 0。
[0012] 在一些實施方案中，邸TA二軸鹽的濃度為0. 05~15mM，優(yōu)選地，0. 1~5mM，更優(yōu) 選地，0. 15~ImM，最優(yōu)選地，0. 2mM，和/或硫酸鎮(zhèn)的濃度為0. 5~80mM，優(yōu)選地，1~50mM， 更優(yōu)選地，5-30mM,最優(yōu)選地，lOmM。
[0013] 在一些實施方案中，試劑1和涉及2的比例為10:1~1:10,優(yōu)選地，5:1~1:1，更 優(yōu)選地，4:1，最優(yōu)選地,3. 75:1。
[0014] 在一些實施方案中，樣品選自體液或生物組織，優(yōu)選地，所述體液選自尿，血液，血 漿，血清，唾液，精液，糞便，姨液，腦脊髓液，巧液，粘液，和羊膜液，更優(yōu)選地，所述體液是血 液，更優(yōu)選地，所述血液樣品被進一步分成血漿或血清級分。
[0015] 在一個實施方案中，試劑1和試劑2的組成如下：
[0016] 試劑 1 :化1:R2 = 3. 75:1)
[0017]
【主權(quán)項】
1. 一種檢測樣品中同型半胱氨酸含量的檢測試劑，其由