紅頸常室繭蜂特異性coi引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，設(shè)及紅頸常室雖蜂特異性C0I引物、含有 其的試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠盲睹Apolygus lucorum(M巧er-Dilr)屬于同翅目盲睹科，是我國(guó)各棉區(qū)的盲睹 優(yōu)勢(shì)種，現(xiàn)已上升為棉田主要害蟲(chóng)。對(duì)于綠盲睹的防治，長(zhǎng)期W來(lái)都未有十分有效的措施， 一般是W化學(xué)農(nóng)藥防治為主。然而，隨著農(nóng)藥的的使用，綠盲睹抗藥性不斷增強(qiáng)，綠盲睹的 防治難度加大。寄生性天敵作為生物防治的手段之一，依靠寄生因子如毒液、多分DNA病 毒、類病毒顆粒、類病毒纖絲、卵巢蛋白、崎形細(xì)胞極其分泌蛋白等方式影響寄主的生殖發(fā) 育最終導(dǎo)致其死亡，在害蟲(chóng)控制方面發(fā)揮著積極重要的作用。
[0003] 由于寄生蜂種類繁多復(fù)雜，且一般個(gè)體較小，從形態(tài)上較難鑒定區(qū)別。若想鑒定寄 主體內(nèi)未成熟發(fā)育階段的寄生蜂，難度將更大。利用分子檢測(cè)手段，不論是對(duì)寄生蜂個(gè)體， 還是對(duì)寄生于寄主體內(nèi)的寄生蜂，均可通過(guò)特異性引物擴(kuò)增完成鑒定，該就大大的減輕了 鑒定工作的強(qiáng)度和難度，節(jié)省時(shí)間，準(zhǔn)確性高。
[0004] 紅頸常室雖蜂（Peristenus sprees Qien&van Achterberg)屬膜翅目雖蜂科，是 綠盲睹若蟲(chóng)寄生蜂。由于寄生蜂在田間不易觀察，且被寄生的綠盲睹易在田間死亡等原因， 一直無(wú)法對(duì)其與綠盲睹的寄生關(guān)系進(jìn)行更好的研究，鑒定工作也受到制約，無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估 紅頸常室雖蜂對(duì)綠盲睹的控制作用。本發(fā)明即提供了一種高效便捷的分子檢測(cè)方法，利用 特異性引物擴(kuò)增有效鑒定紅頸常室雖蜂，為準(zhǔn)確評(píng)估紅頸常室雖蜂對(duì)綠盲睹生物防治效果 提供有效手段支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供紅頸常室雖蜂特異性C0I引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)紅頸常室雖蜂的線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)篩選得 到一對(duì)紅頸常室雖蜂特異性C0I引物，其包括：
[0007] 正向引物 PsFl ;5' -TATTAAGAAGAATAATTGGGATG-3'
[0008] 反向引物 PsRl ;5' -ATTTAAATTTCGATCTGTTAATAAC-3,。
[0009] 本發(fā)明還提供含有引物PsFl和PsRl的用于檢測(cè)紅頸常室雖蜂的試劑盒。所述試 劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg"、PCR反應(yīng)緩沖液等中的至少一種。優(yōu)選地，所述試 劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
[0010] 本發(fā)明還提供所述引物PsFl和PsRl，化及含有引物PsFl和PsRl的試劑盒在檢測(cè) 紅頸常室雖蜂中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供一種紅頸常室雖蜂的特異性快速PCR檢測(cè)方法，包括W下步驟： [001引 1)提取樣品DNA;
[001引 。W步驟1)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物PsFl和PsRl進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0014] 扣分析PCR產(chǎn)物。
[00巧]PCR反應(yīng)體系W 20yL計(jì)為；
[0016]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 紅頸常室繭蜂特異性COI引物，其特征在于，其包括： 正向引物 PsFl :5' -TATTAAGAAGAATAATTGGGATG-3' ； 反向引物 PsRl :5' -AITTAAAITTCGATCTGTTAATAAC-3'。
2. 用于檢測(cè)紅頸常室繭蜂的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1所述的 引物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
5. 權(quán)利要求1所述引物或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述試劑盒在檢測(cè)紅頸常室繭蜂中的應(yīng) 用。
6. 紅頸常室繭蜂的特異性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品DNA ; 2) 以步驟1)提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物PsFl和PsRl進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)； 3) 分析PCR產(chǎn)物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以20 μ L計(jì)為： 模板 DNA l.OpL 2.5mM dNTPs 0.4μΙ.. ΙΟμΜ 引物 PsFl 0.4μL ΙΟμΜ 引物 PsRl 0.4μΙ.. 5U4iL Easy Γ叫 DNA聚合酶 0.2μL 10. Easy 緩沖液 2.0μΙ^ ddH20 補(bǔ)足至 20μΕ。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4分鐘； 94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體提供了紅頸常室繭蜂特異性COI引物、含有其的試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)紅頸常室繭蜂mtDNA的保守序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)紅頸常室繭蜂特異性COI引物PsF1和PsR1(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)，經(jīng)檢測(cè)，該對(duì)引物僅對(duì)紅頸常室繭蜂具有特異性擴(kuò)增能力，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為263bp，靈敏度DNA濃度檢出限為0.625ng/μL。本發(fā)明利用PCR檢測(cè)技術(shù)，由特異性引物擴(kuò)增得到特異性單一條帶，操作簡(jiǎn)單，具有高效、價(jià)廉、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104630367
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510065234
【發(fā)明人】李金花, 楊帆, 羅素萍, 袁海濱, 陸宴輝
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月6日