App等溫?cái)U(kuò)增快速檢測用引物、試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體設(shè)及一種APP等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物、試劑及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[000引 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APF0細(xì)菌是一 種無芽抱、有鞭毛和英膜的革蘭氏陰性小球桿菌，現(xiàn)歸類為放線菌屬（Actinomyces)，包括 2個(gè)生物型15個(gè)血清型，不同血清型之間及同一血清型的不同菌株的毒力均存在差異，致 病性也有強(qiáng)弱之分，從而導(dǎo)致該病的診斷和治療非常困難。化ttison在1957年首次報(bào)道了 豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia, PCP)的爆發(fā)，此后，Mtthews和 化ttison在1961年，olander于1963年相繼報(bào)道了該病。1964年shope報(bào)道了一起爆發(fā) 于阿根廷豬場的類似感染，而本病的病原菌曾由化ope和White等人在1964年根據(jù)其培養(yǎng) 特性而命名為胸膜肺炎嗜血桿菌（化emo地ilus pleuropneumoniae)。后來又經(jīng)Kihan等人 于1978年確定。1983年，Pohi等人通過DNA雜交試驗(yàn)，胸膜肺炎嗜血桿菌和豬流感嗜血桿 菌間沒有明顯的同源性，而與李氏放線桿菌（Actinobacillus lignieresi)之間有較高同 源性。據(jù)此將該菌劃歸于己氏桿菌科（Pasteurellaceae)，放線桿菌屬（Actinobacillus)， 并命名為胸膜肺炎放線桿菌，也就是目前仍在使用的名稱。
[000引 APP是PCP的病原菌，引起豬的呼吸道疾病，對豬有高特異性，是國際上公認(rèn)的危 害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的五大疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。有報(bào)道從黑羊體內(nèi)分離 到該菌，人工感染小鼠后也可W重新分離到該菌。該病菌主要通過呼吸傳播，傳染性強(qiáng)。豬 感染該病后可表現(xiàn)為急性發(fā)病死亡到慢性感染及亞臨床癥狀等經(jīng)過。因此，APP在動(dòng)物群 中傳播對人類的生活和健康存在一定的潛在威脅。同時(shí)豬肉等肉制食品在人們的日常食用 中非常普遍，攜帶該細(xì)菌的肉制品對人的健康存在威脅，因而該細(xì)菌的檢測在出入境和食 品安全檢驗(yàn)中起著重要的作用。
[0004] 我國在20世紀(jì)80年代初期，由于養(yǎng)豬方式大部分W分散飼養(yǎng)為主，本病發(fā)生較 少。20世紀(jì)90年代開始，隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，加上國家及地區(qū)間引種工作的日 益頻繁，本病的發(fā)病率及死亡率大大高于從前。國內(nèi)大多數(shù)省（區(qū)、市）經(jīng)病原學(xué)、血清學(xué) 診斷和檢疫，有此病發(fā)生的報(bào)道。說明PCP在我國已廣泛流行，并有擴(kuò)大蔓延之勢。目前 該病已經(jīng)成為我國豬呼吸系統(tǒng)的主要疾病。
[0005] 國外較多使用PCR方法對APP進(jìn)行快速診斷，所選的目的基因多種多樣，如APX、 olmA、Tbps、ds祀-like等。APP引起豬致病有幾個(gè)毒力因素，溶血素（RT幻、英膜多糖（CP)、 脂多糖（LP巧、外膜蛋白（olmA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tbps)等。RTX存在于大部分致病性革蘭氏陰 性細(xì)菌中，同時(shí)也是APP的主要毒力因子之一。APP的15個(gè)血清型中共發(fā)現(xiàn)了 4種不同的 溶血毒素，即Apx I、Apx IKApx III、Apx IV。近年發(fā)現(xiàn)，沒有一種血清型的APP能同時(shí)分 泌4種毒素，但APP所有血清型在感染動(dòng)物體內(nèi)都能分泌Apx IV毒素蛋白，因此ApxlV毒 素蛋白在建立檢測方法等方面具有潛在的理論價(jià)值和應(yīng)用前景，可用于區(qū)別診斷APP的感 染與非感染。血清PCR檢測雖為主要檢測手段，但其擴(kuò)增受實(shí)驗(yàn)條件、費(fèi)用高、假陽性率高 等因素的限制，不宜廣泛推廣；而血清學(xué)試驗(yàn)僅能反應(yīng)是否感染，并不能檢測細(xì)菌含量和分 型檢測。因此，發(fā)明一種可W同時(shí)鑒別檢測APP15種不同血清型的檢測方法對研究我國豬 肉中APP感染情況具有重要意義。國內(nèi)外在病原體的檢測方法，利用LAMP方法對多種動(dòng)物 疫病和微生物檢測已有很多報(bào)告，但在獸醫(yī)臨床診斷方法，APP診斷方法的報(bào)導(dǎo)并不多且靈 敏度不高。
[0006] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)（loop-mediated isothermal amplication,簡稱LAMP) (國際專利公開號WO 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出的一種核酸擴(kuò)增新技術(shù)，針 對待測祀基因序列的8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一套3對特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶炬St DNA polymerase)在64°C左右等溫條件下能夠特異性、高效、快速的進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可 直接對擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磯酸儀沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或檢測其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的巧光 染料優(yōu)選SYBR Green I染色，即可通過肉眼判定。由于LAMP技術(shù)擴(kuò)增的3對引物是針對 祀基因的8個(gè)區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時(shí)是等溫條件下即不需要PCR儀等特 殊儀器，且樣品的前處理非常簡單、單位時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增效率更高等優(yōu)點(diǎn)，已引起人們的關(guān)注。
[0007] 中國發(fā)明專利（申請?zhí)枮椋?00710030435. (K200710030437. X、200710132320. 2、 200710026389.7、200810052321. (K200810015001. 8、200810093986. 6、200910041358. 8、 200910251055. 9、200910090037. 7、201010555073. 9、201110339104. X 等）分別公開了采用 等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢測病菌和動(dòng)物疫病的方法。但是，目前尚無利用等溫?cái)U(kuò)增基因技術(shù)檢 測APP的試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，將LAMP擴(kuò)增技術(shù)運(yùn)用于APP的快速檢測，本發(fā)明的第一 個(gè)目的是提供一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測用引物，第二個(gè)目的 是提供使用該引物的試劑盒，第=個(gè)目的是提供使用上述檢測用引物的試劑盒的使用方 法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0010] APP等溫?cái)U(kuò)增快速檢測用引物包括：
[0011] DNA序列為SEQ ID NO. 1的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌內(nèi)引物上游FIP ;
[001引 DNA序列為SEQ ID NO. 2的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌內(nèi)引物下游BIP ;
[0013] DNA序列為SEQ ID NO. 3的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外引物上游F3 ;
[0014] DNA序列為SEQ ID NO. 4的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外引物下游B3 ;
[0015] DNA序列為SEQ ID NO. 5的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌環(huán)引物上游LF ;
[0016] DNA序列為SEQ ID NO. 6的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌環(huán)引物下游LB。
[0017] 一種APP等溫?cái)U(kuò)增快速檢測用試劑盒，包括擴(kuò)增反應(yīng)液管、巧黃綠素顯色劑管、陽 性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中：
[0018] 所述擴(kuò)增反應(yīng)液管管內(nèi)由W下反應(yīng)液組成：
[0019] DNA 序列為 SEQ ID NO. 1 的 60mmol/L 的 APP 內(nèi)引物上游 1. 0 y L ;
[0020] DM 序列為 SEQ ID NO. 2 的 60mmol/L 的 APP 內(nèi)引物下游 1. 0 y L ;
[002U DNA 序列為 SEQ ID NO. 3 的 5mmol/L 的 APP 外引物上游 1. 0 y L ;
[002引 DNA序列為SEQ ID NO. 4的5mmol/L的APP外引物下游1. 0 y L ;
[002引 DM序列為SEQ ID NO. 5的30mmol/L的APP環(huán)引物上游1. 0 y L ;
[0024] DM 序列為 SEQ ID NO. 6 的 30mmol/L 的 APP 環(huán)引物下游 1. 0 y L ;
[002引 2 X LAMP buffer 12. 5 y L ;
[0026] 5U/ y L Bst DM 聚合酶 0. 8 y L ;
[0027] 滅菌去離子水3. 7yL;
[002引合計(jì)23 y L為單次反應(yīng)的用量；
[0029] 所述陽性對照管，管內(nèi)為APP陽性重組質(zhì)粒DM,體積為20 y L。
[0030] 所述陰性對照管，管內(nèi)為無APP感染豬肉組織基因組DM,體積為20 y L。
[0031] 所述巧黃綠素顯色劑（Calcein顯色劑）管，管內(nèi)體積為20 y L ;
[0032] 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種利用上述試劑盒的APP等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法；包括如下步 驟：
[0034] (1)樣品中核酸模板的提取：取200化~300化或200mg~300mg待檢樣品，可 選用相應(yīng)的市售商品化核酸提取試劑盒或?qū)嶒?yàn)室常規(guī)使用的提取細(xì)菌核酸的方法提取樣 品中的DNA，即為核酸模板；
[0035] (2) LAMP反應(yīng)體系：取1 y L核酸模板或陽性對照或陰性對照，分別加入LAMP擴(kuò)增 反應(yīng)液23 y L Calcein顯色劑1 y L反應(yīng)體系的總體積為25 y L ;
[0036] (3) LAMP擴(kuò)增條件；將步驟（2)配制好的反應(yīng)體系的PCR管于64 °C恒溫反應(yīng) 60min，80°C終止反應(yīng)；
[0037] (4)結(jié)果判定；通過LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察；陽性 擴(kuò)增在20min內(nèi)可見明顯的實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和濁度擴(kuò)增曲線，陰性無任何擴(kuò)增；或者，反應(yīng)產(chǎn) 物顯現(xiàn)黃綠色則為陽性，澄色則為陰性；或者，通過肉眼觀察鑒定，與陰性對照管比較顯示， 檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
[003引本發(fā)明的原理是：針對一段232bp左右的祀序列上8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6條引物（2條外 引物、2條內(nèi)引物和2條環(huán)引物），利用核酸分子在64°C左右的溫度下處于自然松散狀態(tài)， 采用具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下對目的基因進(jìn)行高效擴(kuò)增，經(jīng)15~ 30min的反應(yīng)，模板擴(kuò)增效率能達(dá)到109~10 W倍。由于該反應(yīng)不需要高溫節(jié)鏈、退火等步 驟，因此不需要昂貴的PCR儀。在反應(yīng)的Buffer反應(yīng)液里加入一種特殊的發(fā)光劑巧黃綠素 顯色劑，巧黃綠素顯色劑本身是一種發(fā)綠光的巧光，在本反應(yīng)中采用的巧黃綠素顯色劑是 被鋪離子整合處理過的，不能發(fā)黃綠色巧光，一旦LAMP反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生的大量焦磯酸根離 子可競爭性地結(jié)合鋪離子，釋放出巧黃綠素顯色劑，導(dǎo)致反應(yīng)呈黃綠色，通過黃綠色巧光的 產(chǎn)生也能判定反應(yīng)結(jié)果。該種比較溫和的溫度條件W及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化， 克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本等缺點(diǎn)、此外，該檢測方法對檢測 人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡單，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立 成本低