一種秸稈腐熟菌劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腐熟菌劑，特別是涉及能快速、原位腐熟農(nóng)作物秸桿的一種秸桿腐熟 菌劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)作物秸桿的主要成分是纖維，且富含氮、磷、鉀、鈣、鎂和有機(jī)質(zhì)等，是一種具有 多用途的可再生的生物資源。我國(guó)農(nóng)作物秸桿年均產(chǎn)量有7億噸，其中三分之一被丟棄或 者焚燒，而秸桿焚燒會(huì)增加空氣中C0 2的含量和可吸入顆粒物等，不僅造成資源浪費(fèi)，還導(dǎo) 致嚴(yán)重的環(huán)境污染，危害人體健康。
[0003] 我國(guó)目前解決大面積秸桿問(wèn)題的主要方法是直接還田，但還田速度慢且直接導(dǎo)致 土壤溫度低，影響作物生長(zhǎng)，因此秸桿還田的生物有效性低。通過(guò)秸桿堆肥可以在一定程度 上提高秸桿的利用率，然而秸桿纖維結(jié)構(gòu)復(fù)雜，單一的微生物對(duì)其分解能力弱，造成秸桿自 然堆肥存在分解周期長(zhǎng)、堆肥質(zhì)量較差等問(wèn)題。腐熟菌劑是多種微生物混合復(fù)配的生物菌 劑，且不同微生物可合成不同酶系。在秸桿中添加腐熟菌劑則可通過(guò)不同微生物的協(xié)同互 補(bǔ)作用有效降解秸桿，增強(qiáng)秸桿的生物利用率，改善土壤肥力，提高農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量，同 時(shí)有效推進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，并實(shí)現(xiàn)資源的可再生利用。但目前的秸桿腐熟劑中存在著 降解纖維復(fù)合酶的酶活不高、原位腐熟效率不佳、評(píng)價(jià)指標(biāo)粗放等問(wèn)題。
[0004] 中國(guó)專利201310611671. 7公開農(nóng)作物秸桿腐熟劑及使用方法，利用該專利制備 腐熟菌劑時(shí)，需要在枯草芽孢桿菌、黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、綠色木霉、米曲霉的混合菌體物 中額外添加纖維素酶制劑，使秸桿腐熟時(shí)間有所縮短；中國(guó)專利201310641595. 4公開一種 低溫狀態(tài)下快速啟動(dòng)腐熟的秸桿腐熟劑及其制備方法，同樣需要在腐熟菌劑加入額外的酶 制劑，從而提高腐熟菌劑的纖維素酶活。
[0005] 秸桿堆腐發(fā)酵后再作為有機(jī)肥還田是目前廣泛采用的一種方法，中國(guó)專利 201010228347. 3、201310666396. 9、201310308892. 7均提供了用于堆腐發(fā)酵的秸桿腐熟菌 劑，而秸桿堆腐發(fā)酵具有費(fèi)勞力、成本高的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有腐熟菌劑存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供高纖維復(fù)合酶酶活且 能克服自然復(fù)雜環(huán)境進(jìn)行原位腐熟，利用微生物和生物酶的協(xié)同作用快速降解秸桿，有效 改善土壤肥力，提高農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境的一種秸桿腐熟菌劑及其制備方法 和應(yīng)用。
[0007] 所述秸桿腐熟菌劑由枯草芽孢桿菌粉劑、長(zhǎng)枝木霉粉劑和灰略紅鏈霉菌粉劑復(fù)配 組成，按質(zhì)量百分比的組成為枯草芽孢桿菌粉劑5%~15%、長(zhǎng)枝木霉粉劑50%~70%、灰 略紅鏈霉菌粉劑25 %~45% ;
[0008] 枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)三炬-07、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)三炬-08 和灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)三炬-09 均已 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101，保藏日期均為2014年12月29 日，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)分別為 CGMCC No. 10248、CGMCC No. 10144、CGMCC No. 10247。
[0009] 所述秸桿腐熟菌劑的制備方法，具體步驟如下：
[0010] 通過(guò)固態(tài)發(fā)酵法分別制備枯草芽孢桿菌、長(zhǎng)枝木霉、灰略紅鏈霉菌的發(fā)酵菌體及 其產(chǎn)物，干燥后粉碎成枯草芽孢桿菌粉劑、長(zhǎng)枝木霉粉劑和灰略紅鏈霉菌粉劑，混合后即得 秸桿腐熟菌劑。
[0011] 通過(guò)固態(tài)發(fā)酵法制備枯草芽孢桿菌的發(fā)酵菌體及其產(chǎn)物所采用的液體種子培養(yǎng) 基的組成可為：葡萄糖20.0g/L、蛋白胨16.7g/L、NaCl 5.3g/L、牛肉膏5.3g/L，pH 7.0; 固態(tài)培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為麩皮93. 97%、豆柏粉4.94%、MgS04 ? 7H20 0.05%、 NH4S040. 05%、CaC030 . 99%，加入培養(yǎng)料總質(zhì)量50%的水后混勻121°C滅菌lh。
[0012] 通過(guò)固態(tài)發(fā)酵法制備長(zhǎng)枝木霉的發(fā)酵菌體及其產(chǎn)物所采用的液體種子培養(yǎng)基的 組成可為：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基粉劑33. 3g/L，pH自然；固態(tài)培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為 麩皮 93. 97 %、豆柏粉 4. 94%、MgS04 ? 7H20 0? 05 %、NH4S040. 05 %、CaC030 . 99 %，加入培養(yǎng) 料總質(zhì)量50%的水后混勻121°C滅菌lh。
[0013] 通過(guò)固態(tài)發(fā)酵法制備灰略紅鏈霉菌的發(fā)酵菌體及其產(chǎn)物所采用的液體種子培養(yǎng) 基的組成可為：小米 20. 0g/L、KN03l. 0g/L、K2HP040. 5g/L、MgS04 ? 7H20 0? 5g/L、NaCl 0? 5g/ L，pH 7. 2 ;固態(tài)培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為小米99.42%、KN030. 1 %、K2HP040.05%、 MgS04 ? 7H20 0? 05%、NaCl 0? 05%、CaC030. 33%，pH 為 7. 2,小米按 1. 8mL/g 的比例加水浸 泡24h后121°C滅菌20min再與其它成分混合。
[0014] 固態(tài)發(fā)酵的條件及其要求如下：
[0015] 枯草芽孢桿菌液體種子以100mL/kg的比例接種至固態(tài)培養(yǎng)基中，于30°C恒溫發(fā) 酵4~8d，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵物水分< 21 %，有效活菌數(shù)為多50億/g ;
[0016] 長(zhǎng)枝木霉液體種子以100mL/kg的比例接種至固態(tài)培養(yǎng)基中，于30°C恒溫發(fā)酵4~ 9d，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵物水分< 20 %，有效活菌數(shù)為多1. 5億/g ;
[0017] 灰略紅鏈霉菌液體種子以100mL/kg的比例接種至固態(tài)培養(yǎng)基中，于50°C發(fā)酵2~ 5d，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵物水分< 15 %，有效活菌數(shù)為多0. 2億/g。
[0018] 所述秸桿腐熟菌劑可在制備秸桿腐熟降解劑中應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明所述秸桿腐熟菌劑，以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、長(zhǎng)枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum)、灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)菌為制備 菌種，將三種菌株分別接種到液體種子培養(yǎng)基中制成種子液，然后再分別按一定比例接種 到固態(tài)培養(yǎng)基中。
[0020] 本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 本發(fā)明采用的枯草芽孢桿菌、長(zhǎng)枝木霉、灰略紅鏈霉菌互不拮抗，且能分泌合成降 解纖維的復(fù)合酶系，三種菌及其分泌的生物酶形成一個(gè)高效的協(xié)同體系，能快速地腐熟秸 桿?？莶菅挎邨U菌具有較高的木質(zhì)素酶、半纖維素酶、纖維素酶的酶活，能有效分解秸桿，提 高秸桿腐熟效果，且枯草芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成短桿菌肽、枯草菌素、多粘菌素 等活性物，能夠有效抑制作物致病菌的生長(zhǎng)。長(zhǎng)枝木霉是產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株之一， 能明顯促進(jìn)以降解纖維素為主的秸桿腐熟過(guò)程。灰略紅鏈霉菌可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，除了 具有纖維素酶活性外，同時(shí)具有多種木質(zhì)纖維素酶活性，可進(jìn)一步加快腐熟速度。
[0022] 本發(fā)明的腐熟菌劑的菌種組合簡(jiǎn)單，制備方法簡(jiǎn)易，三株菌復(fù)配可有效提高秸桿 腐熟全過(guò)程的降解效率，利用三株菌的優(yōu)化組合可使秸桿腐熟的時(shí)間大大縮短，無(wú)需額外 添加酶制劑，最快約可使秸桿腐熟完成提前30d。此外，添加了腐熟菌劑的秸桿在原位腐熟 后，可改善土壤結(jié)構(gòu)與肥力，抑制土壤土傳病害，提高作物的產(chǎn)量與質(zhì)量，具有重要的經(jīng)濟(jì) 價(jià)值和深遠(yuǎn)的生態(tài)意義。因此本發(fā)明制備的所述秸桿腐熟菌劑可在制備秸桿腐熟降解劑中 應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 為使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面列舉本發(fā)明的具體實(shí)施例，詳 細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例中所述試驗(yàn)方法、試劑及材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商 業(yè)途徑獲得或以常規(guī)方法制備。需強(qiáng)調(diào)的是實(shí)施例并非本發(fā)明技術(shù)方案所有可能實(shí)施方式 的窮舉，故不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 本發(fā)明所述秸桿腐熟菌劑的制備方法和田間試驗(yàn)實(shí)施方式如下。
[0025] 實(shí)施例1枯草芽孢桿菌粉劑的制備
[0026] 1、將儲(chǔ)存于4°C冰箱內(nèi)的枯草芽孢桿菌活化，并用接種環(huán)刮取菌落接種至營(yíng)養(yǎng)液 體種子培養(yǎng)基中，30°C、180rpm搖瓶培養(yǎng)2d。液體種子培養(yǎng)基配方（g/L)為葡萄糖20.0、蛋 白胨 16. 7、NaCl 5. 3、牛肉膏 5. 3, pH 7. 0。
[0027] 2、將制備的液體種子液以100mL/kg的比例接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均 勻，于30°C恒溫發(fā)酵8d。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W% )為麩皮93. 97%、豆柏粉4. 94%、 1^04,71120 0.05%、順45040 . 05%、0&0)30.99%，加入培養(yǎng)料重量的50%水后，攪拌均勻， 121°C 滅菌 20min。
[0028] 3、枯草芽孢桿菌經(jīng)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、固態(tài)發(fā)酵8d后其有效活菌數(shù)達(dá)約67億/g，芽孢 數(shù)約50億/g，芽孢率約為83 %，纖維素酶活102U/g，pH 6. 9,水分21 %。
[0029] 4、收集枯草芽孢桿菌菌體及其發(fā)酵產(chǎn)物，用粉碎機(jī)粉碎成粉劑（不超過(guò)10s)，將 粉劑密封備用。
[0030] 實(shí)施例2長(zhǎng)枝木霉粉劑的制備
[0031] 1、將儲(chǔ)存于4°C冰箱內(nèi)的長(zhǎng)枝木霉活化，制備孢子懸浮液，將lmL長(zhǎng)枝木霉的孢子 懸液接種至200mL的營(yíng)養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基中，30°C、180rpm搖瓶培養(yǎng)2d。營(yíng)養(yǎng)液體種子培 養(yǎng)基配方為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基粉劑33. 3g/L，自然pH，121°C滅菌20min。
[0032] 2、將制備的液體種子以為100mL/kg的比例接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均 勻，于30°C恒溫發(fā)酵8d。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W% )為麩皮93. 97%、豆柏粉4. 94%、 1^04,71120 0.05%、順45040.05%、03〇)30 . 99%，加入培養(yǎng)料重量的50%水后攪拌均勻， 121°C 滅菌 lh。
[0033] 3、長(zhǎng)枝木霉經(jīng)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、固態(tài)發(fā)酵8d后其有效活菌數(shù)達(dá)約2. 1億/g，纖維素 酶活達(dá) 94U/g，pH 6. 8,水分 20%。
[0034] 4、收集長(zhǎng)枝木霉菌體及其發(fā)酵產(chǎn)物，用粉碎機(jī)粉碎成粉劑（不超過(guò)10s)，將粉劑 密封備用。
[0035] 實(shí)施例3灰略紅鏈霉菌粉劑的制備
[0036] 1、將儲(chǔ)存于4°C冰箱內(nèi)的灰略紅鏈霉菌活化，用接種環(huán)刮取灰略紅鏈霉菌孢子接 種于200mL營(yíng)養(yǎng)液體種子液搖瓶培養(yǎng)基中，50°C、180rpm培養(yǎng)2d?；衣约t鏈霉菌的液體種 子培養(yǎng)基配方&/1)為小米20.0、謂0 31.0、1(2冊(cè)040.5，]\%504.711 20 0.5、恥(：10.54117.2。
[0037] 2、將制備的液