一種酶-菌雙聯(lián)秸稈腐熟劑及其制備方法和使用方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于農作物秸桿處理技術領域，具體涉及一種酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑及其制備方法和使用方法。
【背景技術】
[0002]我國是農業(yè)大國，各類農作物秸桿資源十分豐富，秸桿年產量達7億多噸。隨著農村能源問題的解決，秸桿不再作為主要燃料使用，被集中焚燒的現(xiàn)象日益突出，不僅污染環(huán)境，危害人們的身體健康，而且煙霧彌漫，影響陸地交通和飛行安全。秸桿的主要成分是纖維素(約含42% )、半纖維素(約含32% )和木質素(約8% )，并含有氮、磷、鉀、鈣、鎂和有機質等。因此，合理的開發(fā)利用農作物秸桿顯得尤為重要。
[0003]目前，針對秸桿無害化處理，使用秸桿腐熟劑利用微生物發(fā)酵代謝作用將秸桿中的纖維素、半纖維素、木質素等分解為葡萄糖等養(yǎng)分后再重新施回土壤是一項簡單實用的方法。但是目前的秸桿腐熟劑存在著菌劑混配單一，功能性菌株偏少，腐熟溫度低，腐熟效果不良好，周期長，很多要在地下降解幾年才能徹底降解，影響下茬作物生長，沒有很好的起到促進作物增產增收的良好效果的諸多情況。
[0004]另外，由于纖維素是葡萄糖脫水、通過β_1，4葡萄糖苷鍵連接而成的直鏈聚合體，纖維素分子間通過大量的氫鍵連接在一起形成晶體結構的纖維素束，纖維素束主要被半纖維素包圍，其次是被木質素的環(huán)鞘包圍，由此形成了天然復雜致密的結構。盡管許多微生物能分解單獨存在的纖維素，但由于上述原因，利用微生物分解秸桿受到限制。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題，提供一種綠色環(huán)保，秸桿腐熟快速、徹底、高效，能徹底分解秸桿生物大分子，改善土壤質量，減少化肥施用量，同時及時補給接茬作物生長所需多種營養(yǎng)的酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是為了提供一種酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑的制備方法和使用方法。
[0007]為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:一種酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑，由重量比為3-4:1的微生物復合菌劑和復合酶劑混合而成，所述微生物復合菌劑包括綠色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、側孢短芽孢桿菌和酵母融合菌，所述綠色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、側孢短芽孢桿菌和酵母融合菌的重量比為1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述復合酶劑包括發(fā)酵里氏木霉產生的纖維素酶、發(fā)酵枯草芽孢桿菌產生的半纖維素酶、發(fā)酵糙皮側耳菌產生的木質素酶，所述纖維素酶、半纖維素酶和木質素酶的重量比為1-2:1-2:1-2。
[0008]一種酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑的制備方法，該方法包括以下步驟:
Α、制備微生物復合菌劑
a、制備綠色木霉菌原粉:將綠色木霉菌孢子粉與面粉按照重量比1:500混勻后接種到培養(yǎng)基上，然后放入無菌發(fā)酵室內，溫度控制在30°C，發(fā)酵時間為35-40小時，發(fā)酵完成后進行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存?zhèn)溆茫频镁G色木霉菌原粉；
b、制備黑曲霉原粉:將黑曲霉孢子粉與面粉按照重量比1:500混勻后接種到培養(yǎng)基上，然后放入無菌發(fā)酵室內，溫度控制在30°C，發(fā)酵時間為35-40小時，發(fā)酵完成后進行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存?zhèn)溆茫频煤谇乖郏?br> c、制備米曲霉原粉:將米曲霉孢子粉與面粉按照重量比1:500混勻后接種到培養(yǎng)基上，然后放入無菌發(fā)酵室內，溫度控制在30°C，發(fā)酵時間為35-40小時，發(fā)酵完成后進行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存?zhèn)溆茫频妹浊乖郏?br> d、制備側孢短芽孢桿菌原粉:將側孢短芽孢桿菌轉接到事先準備好的試管斜面上，28-32°C培養(yǎng)18-24小時后再轉入三角瓶培養(yǎng)18-24小時，檢查確認無雜菌后用作發(fā)酵罐接種，發(fā)酵罐培養(yǎng)8小時后，開始取樣鏡檢，當芽孢形成率達到90-95%時培養(yǎng)完成；將發(fā)酵液通過離心機進行濃縮，成為濃縮發(fā)酵液；將濃縮發(fā)酵液打入調配罐內，加入濃縮發(fā)酵液重量20-40%的輕質碳酸鈣攪拌均勻，然后將其通過噴霧干燥塔進行干燥，保持噴出的側孢短芽孢桿菌原粉的水分重量百分比含量在5-6% ;將噴霧干燥塔塔底和旋風口處的側孢短芽孢桿菌原粉進行混合，混合均勻后密封保存?zhèn)溆茫?br> e、制備酵母融合菌原粉:將酵母融合菌轉接到事先準備好的試管斜面上，28-32Γ培養(yǎng)24-72小時后再轉入三角瓶培養(yǎng)24-72小時，檢查確認無雜菌后用作發(fā)酵罐接種，發(fā)酵罐培養(yǎng)24-72小時后，完成發(fā)酵；將發(fā)酵液通過離心機進行濃縮，成為濃縮發(fā)酵液；將濃縮發(fā)酵液打入調配罐內，加入濃縮發(fā)酵液重量20-40%的輕質碳酸鈣攪拌均勻，然后將其通過噴霧干燥塔進行干燥，保持噴出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6% ;將噴霧干燥塔塔底和旋風口處的酵母融合菌原粉進行混合，混合均勻后密封保存?zhèn)溆茫?br> f、復合菌劑組配:將制得的綠色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、側孢短芽孢桿菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1-2:1-2:1-2:2-3:2-3進行復合組配，各組份混合均勻得到復合菌劑；
B、制備復合酶劑
a、制備纖維素酶:
(1)種子的活化:將里氏木霉接種到PDA固體培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)5-6天備用；
(2)液體種子培養(yǎng):用孢子接種器在已活化的PDA固體培養(yǎng)基上挑取一環(huán)孢子接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于30°C，150r/min搖床上培養(yǎng)2d，作為液體種子；
(3)發(fā)酵罐發(fā)酵:將液體種子按5-10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐的裝液量為60-80%，于28°C培養(yǎng)，控制通氣量為0.2-lvvm,轉速為120_150r/mim，發(fā)酵液pH值大于4.0，加入消泡劑，待發(fā)酵液粘度明顯降低時終止發(fā)酵，發(fā)酵結束后，發(fā)酵液經板框分離，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液經離心機3500r/min離心10_15min，取上清即為纖維素酶粗酶液；
(4)纖維素酶固體粉末:取纖維素酶粗酶液，向其中加入硫酸鈉充分溶解，再經過霧化器霧化成細小的霧滴，然后在干燥塔內干燥，制得纖維素酶固體粉末；
b、制備半纖維素酶:
(1)種子的活化:將4°C冷藏的枯草芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)24h，進行菌種活化；
(2)液體種子培養(yǎng):在已活化的斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌體接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于37°C、120-150rmp震蕩培養(yǎng)24h，即為種子液； (3)發(fā)酵罐發(fā)酵:將液體種子按10%的接種量接種于發(fā)酵罐，發(fā)酵罐的裝液量為70%，pH為7.5，溫度37°C，控制前期通氣量為1:0.8，后期通氣量為1: 1，加入消泡劑，培養(yǎng)48小時后收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液經離心機3500r/min離心10_15min，取上清即為半纖維素酶粗酶液；
(4)半纖維素酶固體粉末:取半纖維素酶粗酶液，向其中加入硫酸鈉充分溶解，再經過霧化器霧化成細小的霧滴，然后在干燥塔內干燥，制得半纖維素酶固體粉末；
c、制備木質素酶:
(1)種子的活化:將糙皮側耳菌接種到PDA固體培養(yǎng)基上28°C下培養(yǎng)5-6天；
(2)液體種子培養(yǎng):在已活化的PDA固體培養(yǎng)基上挑取一環(huán)孢子接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于30°C，150r/min搖床上培養(yǎng)2d，作為液體種子；
(3)通氣罐發(fā)酵:將液體種子按10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐的裝液量為60%-80%，于28°C培養(yǎng)，控制通氣量為0.2-lvvm，轉速為120_150r/mim，發(fā)酵液pH值為4.0，加入消泡劑，待發(fā)酵液粘度明顯降低時終止發(fā)酵，發(fā)酵結束后，發(fā)酵液經板框分離，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液經離心機3500r/min離心10_15min，取上清即為木質素酶粗酶液；
(4)木質素酶固體粉末:取木質素酶粗酶液，向其中加入硫酸鈉充分溶解，再經過霧化器霧化成細小的霧滴，然后在干燥塔內干燥，制得木質素酶固體粉末；
d、復合酶劑組配:將上述纖維素酶固體粉末、半纖維素酶固體粉末、木質素酶固體粉末按重量比1-2:1-2:1-2進行混合，制成復合酶劑；
C、腐熟劑組配:將制得的微生物復合菌劑和復合酶劑按重量比3-4:1混合，制成酶-菌雙聯(lián)秸桿腐熟劑。
[0009]進一步地，所述步驟A中制備綠色木霉菌原粉、黑曲霉原粉和米曲霉原粉時的培養(yǎng)基制備方法為:將以下各原料按重量比混合均勻:麩皮66%、豆柏粉15%、玉米皮15%、硫酸鎂0.3%、硫酸銨3.5%、磷酸二氫鉀0.2%，加入混合物料重量30-40%的水攪拌均勻。
[0010]進一步地，所述步驟A中制備側孢短芽孢桿菌原粉時的斜面培養(yǎng)基為:每升蒸餾水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂20g ;三角瓶培養(yǎng)基為:每升蒸餾水中加入牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g ;發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:每升蒸餾水中加入玉米粉15g、黃豆餅粉
11.5g、玉米漿 10g、酵母膏 0.7g、K2HP04 lg、CaC03 0.5g。。
[0011]進一步地，所述步驟A中制備酵母融合菌原粉時的斜面培養(yǎng)基為:每升蒸餾水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、瓊脂20g ;三角瓶培養(yǎng)基為:每升蒸餾水中加入酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g ;發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:發(fā)酵罐培養(yǎng)基為:每升蒸餾水中加入酵母粉 10g、蛋白胨 10g、葡萄糖 20g、KH2P04 lg、MgS04*7H20 0.5g、NaCl 5g，pH值 7.0~7.2。
[0012]進一步地，所述步驟Β中制備纖維素酶時PDA固體培養(yǎng)基的制備方法為:將200g馬鈴薯去皮切碎，煮沸30min，然后用雙層紗布過濾，加入20g葡萄糖，加入瓊脂15_20g，加水至 1000mL，121°C 滅菌；
液體種子培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入葡萄糖20g、蛋白胨lg、Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液100mL、Mandels微量元素濃縮液lmL、lmol/L檸檬酸緩沖液50mL，PH為5.5-6.0 ;其中:Mandels營養(yǎng)鹽濃縮液為:每升蒸餾水中加入(NH4)2S04 14 g、尿素3 g、ΚΗ2Ρ04 20g、CaCl2.2H20 4 g、MgS04.7H20 3 g ;Mandels微量元素濃縮液為:每升蒸饋水中加入FeS04.7H20 5 g、ZnS04.7H20 1.4 g、CoCl2.6H20 3.7 g、MnS04.H20 1.6 g ； 發(fā)酵罐產酶培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入蛋白胨3g、酵母膏0.5g、(NH4) 2S04 2g、ΚΗ2Ρ044g、CaCl2.2Η20 0.3g、MgS04.7H20 0.3g、Tween- 80 0.2mL、微晶纖維素 20g、小麥麩皮 30g，121 °C滅菌20 min后使用。
[0013]進一步地，所述步驟B中制備半纖維素酶時斜面培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入牛肉膏 3g、蛋白陳 10g、NaCl 58、瓊脂2(^，？!17.0-7.2，121°(:滅菌201^11 ；
液體種子培養(yǎng)基:每升蒸餾水中加入牛肉膏3g、蛋白陳10g、NaCl 5g，pH7.0_7.2，121°C 滅菌 20min ；
發(fā)酵培養(yǎng)基:每升蒸饋水中加入糖蜜10g、魚粉10g、NaCl 2.