羊水細(xì)胞及其用圖
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2009年10月23日、申請?zhí)枮?200980146959. 3"、發(fā)明名稱為 "羊水細(xì)胞及其用途"的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/US2009/005779 的中國國家階段申請。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求2008年10月24日提交的美國臨時(shí)申請61/108, 313的優(yōu)先權(quán)，該申 請通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及從羊水中獲得的干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及其分離、培養(yǎng)、分化方法及其用 途領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0005] 急性和慢性腎臟疾病是全世界的重大健康問題。患有終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD)患者的數(shù)量在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家中不斷增加（Thadhani等， 1996)。如美國腎臟數(shù)據(jù)系統(tǒng)2005年年度數(shù)據(jù)報(bào)告所報(bào)道，超過400, 000美國人患有ESRD， 并且超過20, 000人正等待腎移植。根據(jù)對(duì)2020年的預(yù)測，預(yù)期將有超過500, 000美國人 患 ESRD。
[0006] 使用羊水作為胎兒遺傳性和先天性疾病的安全可靠的篩選工具已經(jīng)有許多年。在 妊娠期中，羊水的體積和組成隨著發(fā)育中胎兒的生理變化而改變。已經(jīng)表明羊水的分子組 成和營養(yǎng)物質(zhì)的存在對(duì)多種腸細(xì)胞類型（例如上皮細(xì)胞和粘膜細(xì)胞）的增殖和分化具有關(guān) 鍵作用（Cellini 等，2006)。
[0007] 羊水與發(fā)育中胎兒的隔室（例如肺和胃腸道）之間的接觸可以解釋羊水環(huán)境中不 同細(xì)胞類型的存在。已經(jīng)在羊水中發(fā)現(xiàn)了來源于所有3個(gè)胚層的成熟細(xì)胞系，包括間充質(zhì) 細(xì)胞、造血細(xì)胞以及表達(dá)來自特定組織類型（例如腦、心臟和胰腺）之蛋白和多種標(biāo)志物的 細(xì)胞（Hoehn 和 Salk，1982 ;Gosden，1983 ;Torricelli 等，1993)。但是還需要進(jìn)一步研宄， 以根據(jù)其來源和功能對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行完全分類（Tsangaris等，2004 ;Bossolasco等，2006 ; McLaughlin 等，2006)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 申請人已經(jīng)通過隨著時(shí)間跟蹤其存在和研宄羊水細(xì)胞組成在妊娠期間發(fā)生的變 化對(duì)羊水總細(xì)胞群進(jìn)行了表征，集中研宄了來源于3個(gè)胚層的細(xì)胞和器官的祖細(xì)胞。已經(jīng) 從羊水中分離出顯示出腎臟祖細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，包括腎小管和腎小球前體。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了經(jīng)分離和純化的、來源于羊水的CD24和0B-鈣粘蛋 白陽性腎臟祖細(xì)胞群。一個(gè)實(shí)施方案提供了來源于羊水之CD24和0B-鈣粘蛋白陽性腎臟 祖細(xì)胞的克隆群。另一個(gè)實(shí)施方案提供了還表達(dá)E-媽粘蛋白、腎病蛋白（nephrin)、TrkA、 roGFR-a、足糖萼蛋白（podocalixin)或其組合的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞具 有被誘導(dǎo)分化成后腎細(xì)胞、足細(xì)胞（podocyte)、腎小球細(xì)胞、近端和遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞、 基質(zhì)源性（stromogenic)間充質(zhì)細(xì)胞或系膜細(xì)胞的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在體內(nèi) 或離體誘導(dǎo)所述細(xì)胞群分化。
[0010] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含來源于羊水的⑶24和0B-鈣粘蛋白陽性 腎臟祖細(xì)胞群、以及可藥用載體和/或培養(yǎng)基。另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種制備組合物的 方法，包括將來源于羊水的CD24和0B-鈣粘蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞或由其分化的后代與載體 (例如細(xì)胞培養(yǎng)基）相混合。
[0011] 另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種產(chǎn)生來源于羊水之腎臟祖細(xì)胞群的方法，包括從羊水 樣品中選擇CD24和0B-鈣粘蛋白陽性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用抗CD24抗體和抗 0B-鈣粘蛋白抗體（例如單克隆抗體、多克隆抗體或者與熒光團(tuán)或磁性顆粒綴合的抗體）進(jìn) 行所述選擇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步對(duì)來源于羊水的CD24和0B-鈣粘蛋白陽性腎臟 祖細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)E-鈣粘蛋白、腎病蛋白、TrkA、PDGFR-a、足糖萼蛋白或其組合的選擇。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述選擇通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行，例如熒光活化細(xì)胞分選或高梯度磁性選 擇（high gradient magnetic selection)〇
[0012] 一個(gè)實(shí)施方案提供了通過本文所述任一種方法制備的、經(jīng)分離和純化的、來源于 羊水的CD24和0B-鈣粘蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞群。
[0013]另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種使富含來源于羊水之腎臟祖細(xì)胞的細(xì)胞群增殖的方 法，包括：從羊水樣品中選擇至少一個(gè)CD24和0B-鈣粘蛋白陽性細(xì)胞；將所述至少一個(gè)細(xì) 胞加入到培養(yǎng)基中；以及使所述至少一個(gè)經(jīng)選擇的細(xì)胞在培養(yǎng)基中增殖。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述細(xì)胞還表達(dá)E-鈣粘蛋白、腎病蛋白、TrkA、PDGFR- a、足糖萼蛋白或其組合。
[0014]-個(gè)實(shí)施方案提供了一種使經(jīng)分離和純化的、來源于羊水的CD24和0B-鈣粘蛋白 陽性腎臟祖細(xì)胞群分化的方法，包括使所述細(xì)胞群與至少一種分化因子接觸，所述分化因 子包括但不限于ATRA、維生素3、地塞米松、BMP-7、多種不同類型的IV型膠原或其組合。
[0015] 另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種儲(chǔ)存經(jīng)分離和純化的、來源于羊水的⑶24和0B-鈣粘 蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞群的方法，包括從人對(duì)象中獲得羊水樣品；從所述樣品中分離CD24和 0B-鈣粘蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞群；以及冷凍保存來源于羊水的CD24和0B-鈣粘蛋白陽性腎 臟祖細(xì)胞。
[0016] -個(gè)實(shí)施方案提供了一種預(yù)防或治療腎臟疾病或損傷的方法，包括向?qū)ο螅ɡ?哺乳動(dòng)物，包括人類）施用治療疾病或損傷有效量的來源于羊水之CD24和0B-鈣粘蛋白陽 性腎臟祖細(xì)胞或由其分化的后代。另一個(gè)實(shí)施方案提供了一種預(yù)防或治療腎臟疾病或損傷 的方法，包括向?qū)ο笫┯弥委熂膊』驌p傷有效量的從羊水中分離和純化之c-kit陽性細(xì)胞 或者由其分化的后代。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過局部或全身注射施用所述細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述疾病包括糖尿病性腎病、膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、膜增生性腎小球腎炎、彌 漫增生性腎小球腎炎、膜性局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、輕度腎小球病變、系膜增殖性腎小球 腎炎、管內(nèi)增殖性腎小球腎炎、系膜毛細(xì)血管性腎小球腎炎、高密度沉積性腎小球腎炎、新 月體性腎小球腎炎、硬化性腎小球腎炎、缺血性腎病、基于系統(tǒng)性疾病的腎小球疾病、基于 血管疾病的腎小球疾病、基于代謝性疾病的腎小球疾病、遺傳性腎臟病變或移植腎小球病 變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是奧爾波特綜合征。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷是物理 性創(chuàng)傷的結(jié)果（例如由于外科手術(shù)或事故或化學(xué)物質(zhì)（例如過量使用化學(xué)品））。
[0018] 另一個(gè)實(shí)施方案提供了由本文所公開任一種方法生產(chǎn)的、經(jīng)分離和純化的、來源 于羊水的CD24和OB-鈣粘蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞群，其用于醫(yī)學(xué)治療。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述醫(yī)學(xué)治療是治療由于損傷或疾病所致的腎臟傷害。
[0019] -個(gè)實(shí)施方案提供了由本文所公開任一種方法生產(chǎn)的、經(jīng)分離和純化的、來源于 羊水的CD24和OB-鈣粘蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞群在制備用于治療由于損傷或疾病所致腎臟 傷害的藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物包含生理學(xué)上可接受的載體和/或細(xì) 胞培養(yǎng)基。
【附圖說明】
[0020] 圖1顯示用于通過RT-PCR和Western印跡分析對(duì)人羊水細(xì)胞群中3個(gè)胚層和器 官祖細(xì)胞進(jìn)行表征之標(biāo)志物的圖。
[0021] 圖2顯示用于通過RT-PCR和Western印跡分析對(duì)人羊水細(xì)胞群中多能細(xì)胞進(jìn)行 表征之標(biāo)志物的圖。
[0022] 圖3顯示用于通過RT-PCR和Western印跡分析對(duì)腎臟定向分化為之人羊水細(xì)胞 群和其衍生亞群進(jìn)行表征之標(biāo)志物的圖。
[0023] 圖4顯示通過RT-PCR(A)和Western印跡⑶測定3個(gè)胚層之標(biāo)志物隨時(shí)間的表 達(dá)。
[0024] 圖5顯示⑶24+OB-鈣粘蛋白+細(xì)胞群與⑶24 _OB-鈣粘蛋白_選擇進(jìn)行比較的 RT-PCR。
[0025] 圖6顯示通過RT-PCR(A)和Western印跡⑶測定不同孕齡樣品中腎臟祖細(xì)胞標(biāo) 志物的表達(dá)。
[0026] 圖7顯示CD24+OB-鈣粘蛋白+衍生亞群的RT-PCR。
[0027] 圖8顯示總羊水細(xì)胞群（A，B)和CD24+OB-鈣粘蛋白+細(xì)胞群（C，D)的形態(tài)。
[0028] 圖9顯示通過RT-PCR⑷和Western印跡⑶測定不同孕齡樣品中祖細(xì)胞標(biāo)志物 的表達(dá)。
[0029] 圖10描述了顯示中胚層、內(nèi)胚層和外胚層標(biāo)志物表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR。
[0030] 圖11顯示多能細(xì)胞、造血細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的實(shí)時(shí)PCR。
[0031] 圖12顯示祖細(xì)胞標(biāo)志物的實(shí)時(shí)PCR。
[0032] 圖13顯示腎臟祖細(xì)胞的實(shí)時(shí)PCR。
[0033] 圖14顯示實(shí)驗(yàn)中使用的人引物、產(chǎn)物大小和退火溫度的列表。
[0034] 圖15A-C :A. hAFSC細(xì)胞群的形態(tài)。在培養(yǎng)基中傳代40次后，在亮視野（10X)中 細(xì)胞呈纖維母細(xì)胞樣外觀。B.注射前hAFSC的RT-PCR。無早期和成熟腎臟標(biāo)志物的表達(dá)。 使用肌動(dòng)蛋白作為看家基因（390bp)。C.傳代38次后hAFSC的核型。細(xì)胞沒有表現(xiàn) 出任何異常，并且具有正常的核型。
[0035] 圖16A-D:A.nu/nu小鼠腎臟的組織切片（H&E)。皮層易于與髓質(zhì)區(qū)分開。以箭 頭標(biāo)示的腎小管和腎小球呈現(xiàn)正常的形態(tài)（l〇X)。B.甘油-橫紋肌溶解誘導(dǎo)ATN 3天后 nu/nu小鼠腎臟的組織切片（H&E)。腎小球仍然存在（箭頭）并且沒有損傷，而腎小管受損 (10X)。C.nu/nu小鼠腎臟的組織切片（PAS染色）。腎小管和腎小球是完整的，并且與受 損體相比呈現(xiàn)正常的形態(tài)。（D)值得注意的是管腔內(nèi)管型（intraluminar cast)形成（箭 頭）、刷狀邊緣被破壞（箭頭）以及結(jié)構(gòu)被破壞。
[0036] 圖17A-D :A.對(duì)照（左側(cè)未受感染的hAFSC)和經(jīng)編碼螢光素酶的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 hAFSC (右側(cè)）暴露于螢光素酶的底物（螢光素）中，并且經(jīng)發(fā)光測定，螢光素酶在AFSC中 的體外表達(dá)持續(xù)至20pds后。B.測定在生物發(fā)光成像下檢測到之最少量AFSC的體外實(shí)驗(yàn)。 已確定IX 105個(gè)細(xì)胞是為了檢測信號(hào)而可注射的最少細(xì)胞數(shù)。C.向受損nu/nu小鼠腎臟注 射后生物發(fā)光檢測AFSC的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。將1. 2X106個(gè)AFSC直接注射到右腎中，用左腎作為 對(duì)照。第1個(gè)小圖顯示剛剛注射后螢光素酶的表達(dá)。5小時(shí)后信號(hào)非常強(qiáng)（第2個(gè)小圖）， 24小時(shí)后也是如此（第3個(gè)小圖）。信號(hào)在約第6天開始減弱（第5個(gè)小圖），并且在隨后 幾天不明顯（第6-7個(gè)小圖）。如第8個(gè)小圖所顯示，其在第20天后再次出現(xiàn)。D.RT-PCR 表明與注射前（陽性對(duì)照）和未經(jīng)注射（陰性對(duì)照）腎臟的細(xì)胞相比，經(jīng)注射的腎臟中存 在螢光素酶序列（500bp)。用肌動(dòng)蛋白作為看家基因（390bp)。E.hAFSC注射3周后 腎臟的免疫熒光染色。紅色熒光（箭頭）證實(shí)存在表達(dá)螢光素酶的hAFSC。細(xì)胞核用dapi 染色（20X)。
[0037] 圖18A-F :A. hAFSC注射1周后腎臟的冷凍切片。在由表面標(biāo)志物CM-Dil產(chǎn)生的紅 色熒光下，細(xì)胞很明顯。細(xì)胞核用DAPI染色（30X)。B. hAFSC注射3周后腎臟的雙免疫熒 光染色。Aqp2的陽性表達(dá)通過紅色熒光顯示，而綠色熒光則顯示螢光素酶的表達(dá)。對(duì)腎小管 中同時(shí)表達(dá)兩種標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)行雙重染色（箭頭）。細(xì)胞核用DAPI染色（30 X)。C. hAFSC 注射3周后腎臟的免疫熒光染色。紅色熒光顯示經(jīng)表面標(biāo)志物CM-Dil標(biāo)記的hAFSC。值 得注意的是，hAFSC定位于腎小管結(jié)構(gòu)附近。綠色熒光顯示hAFSC中花生凝集素（Peanut Agglutinin)的表達(dá)。細(xì)胞核用DAPI染色（40X)。D. hAFSC注射3周后腎臟的免疫熒光染 色。紅色熒光顯示經(jīng)表面標(biāo)志物CM-Dil標(biāo)記的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于腎小 管結(jié)構(gòu)附近。綠色焚光顯示hAFSC中雙花扁豆凝集素（Dolichus Biflorus Agglutinin)的 表達(dá)（箭頭）。細(xì)胞核用dapi染色（40X)。E. hAFSC注射3周后腎臟的免疫熒光染色。紅 色熒光顯示經(jīng)表面標(biāo)志物CM-Dil標(biāo)記的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于腎小球結(jié)構(gòu) 附近。綠色焚光顯示hAFSC中膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial Derived Neurotrophic Factor)的表達(dá)（箭頭）。細(xì)胞核用DAPI染色（40X)。EhAFSC注射3周后的RT-PCR。細(xì) 胞表達(dá)NPHS1、AQP2、PAX2、0CLN，用ACTB作為看家基因。
[0038] 圖19描述了顯示當(dāng)向患有甘油誘導(dǎo)之ATN的nu/nu小鼠注射hAFSC時(shí)在3天期 間內(nèi)hAFSC對(duì)血肌酸酐之影響的圖。對(duì)照組（僅有損傷以及損傷加上載體對(duì)照PBS)顯示 在48h至72h之間肌酸酐水平的增加，而經(jīng)hAFSC處理的小鼠則沒有顯示峰圖，其維持與生 理參數(shù)0. 6mg/dl相近的肌酸酐水平。
[0039] 圖20提供了一組柱狀圖，其詳細(xì)描述了與向腎中注射hAFSC同時(shí)與肌內(nèi)注射甘油 以誘導(dǎo)ATN的小鼠相比，在對(duì)照小鼠（綠色）、患有甘油誘導(dǎo)之橫紋肌溶解ATN的小鼠（藍(lán) 色）腎臟中表達(dá)的小鼠和人類細(xì)胞因子譜（鼠源細(xì)胞因子以紅色陰影條顯示，人源細(xì)胞因 子以紅色條顯示）。數(shù)值為平均值土SD。細(xì)胞因子基于其在炎癥期間主要的生物學(xué)活性分 成4個(gè)廣義功能組：1.抗炎性；2.促炎性；3.化學(xué)吸引劑；以及4.多種生物學(xué)作用。在24h 和48h評(píng)估了小鼠全腎中表達(dá)的細(xì)胞因子譜。
[0040] 圖21描述了通過實(shí)時(shí)PCR測定的在亞群AKPC中表達(dá)之基因的總結(jié)。
[0041] 圖22描述了在羊水（AF)中鑒定出的不同細(xì)胞譜系。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 申請人已通過跟蹤羊水總細(xì)胞群隨時(shí)間的存在并研宄羊水細(xì)胞組成在妊娠期間 發(fā)生的變化對(duì)羊水總細(xì)胞群進(jìn)行了表征，集中研宄了來源于3個(gè)胚層的細(xì)胞和器官的祖細(xì) 胞。已經(jīng)從羊水中分離出了顯示腎臟祖細(xì)胞（包括腎小管和腎小球前體）特性的細(xì)胞亞群。 這些細(xì)胞已經(jīng)用于例如醫(yī)學(xué)治療和研宄中。
[0043] 定義
[0044] 本文中使用的下列術(shù)語定義為下述含義：
[0045]"祖細(xì)胞"是在干細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生的細(xì)胞，具有其終末分化的后代的一些但非 所有特性。所定義的祖細(xì)胞，例如"腎臟祖細(xì)胞"，是指某譜系（腎臟的），而不是特定的或 終末分化的細(xì)胞類型。
[0046] 術(shù)語"經(jīng)分離"或"經(jīng)富集的群"是指不與一種或多種細(xì)胞或者一種或多種細(xì)胞組 分相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞，所述一種或多種細(xì)胞組分與體內(nèi)在細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。
[0047] "對(duì)象"是脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，包括人。哺乳動(dòng)物包括但不限于人、農(nóng)場動(dòng)物、 運(yùn)動(dòng)動(dòng)物（sport animal)和伴侶動(dòng)物。術(shù)語"動(dòng)物"包括狗、貓、魚、沙鼠、豚鼠、倉鼠、馬、 兔、豬、小鼠、猴（例如猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩）、大鼠、綿羊、山羊、牛和鳥。能夠受益于本 發(fā)明細(xì)胞和方法的對(duì)象包括但不限于由于物理性損傷或疾病相關(guān)損傷而導(dǎo)致腎細(xì)胞功能 喪失的那些對(duì)象。
[0048] "有效量" 一般是指提供所期望的局部或全身效果和/或性能的量，特別是用于治 療目標(biāo)病癥時(shí)。例如，有效量是足以產(chǎn)生有益或所期望之臨床效果的量。所述劑量可以一 次或多次施用，并且可以包括任意預(yù)選的細(xì)胞量?？梢曰诿總€(gè)對(duì)象各自的因素來精確確 定被認(rèn)為是有效劑量的量，所述因素包括其身材大小、年齡、損傷大小以及從損傷發(fā)生或患 病開始計(jì)的時(shí)間長短。本領(lǐng)域技術(shù)人員，特別是醫(yī)生，應(yīng)當(dāng)能夠確定構(gòu)成有效劑量的細(xì)胞數(shù) 量。
[0049] "擴(kuò)增"是指細(xì)胞增殖而不分化。
[0050] 本文中使用的"進(jìn)行性腎病"是指隨時(shí)間推移（例如天、周、月、年）而導(dǎo)致腎功能 喪失的任意腎病。
[0051] "腎功能" 一般是指腎臟的生理學(xué)性質(zhì)，例如滯留蛋白從而防止蛋白尿癥（例如尿 肌酸酐，蛋白質(zhì)的排泄量大于約0. 15克/24小時(shí)）的能力?？梢岳缤ㄟ^腎小球?yàn)V過率 (例如肌酸酐清除）、尿蛋白排泄、血尿氮素、血清或血漿肌酸酐或者其任意組合來對(duì)腎功 能進(jìn)彳T評(píng)估。
[0052]"足細(xì)胞"是腎臟臟層上皮中特化的、高度分化的周細(xì)胞樣細(xì)胞。足細(xì)胞形成 腎小球過濾屏障的重要組分，對(duì)其大小和電荷選擇起作用，并且維持大量的過濾表面。 "Pedicel"（或者"足突"）從足細(xì)胞中延伸出來。這些精巧的足突覆蓋在腎小球毛細(xì)血管 的外基底膜表面上。相鄰的足細(xì)胞相互交叉，覆蓋在與腎小球毛細(xì)血管緊密聯(lián)系的基底膜 上；但是，仍然存在間隙或細(xì)微的濾過隙。當(dāng)足細(xì)胞收縮時(shí)，導(dǎo)致濾過隙關(guān)閉。這通過減少過 濾可用的表面區(qū)域使得腎小球?yàn)V過率（GFR)降低。此外，已知足細(xì)胞使得基質(zhì)分子合成腎 小球基底膜（GBM)，包括IV型膠原、層粘連蛋白、巢蛋白（entactin)和聚集蛋白（agrin)。 足細(xì)胞損傷或缺失導(dǎo)致蛋白尿癥，其中大量蛋白從血液中流失。此外，足細(xì)胞缺失是糖尿病 性和非糖尿病性進(jìn)行性慢性腎?。–KD)的標(biāo)志。
[0053] "自我更新"是指產(chǎn)生復(fù)本子代細(xì)胞的能力，所述復(fù)本子代細(xì)胞具有與其來源細(xì)胞 相同的分化潛能。本文中使用的類似術(shù)語是"增殖"。
[0054] 本文中使用的"治療"包括治療、逆轉(zhuǎn)、預(yù)防、改善或抑制損傷或疾病相關(guān)狀況，或 者損傷或疾病相關(guān)狀況的癥狀。
[0055] "共施用"可包括同時(shí)和/或依次施用兩種或更多種藥劑/細(xì)胞類型。
[0056] 術(shù)語"包含"、"包括"等具有美國專利法中所描述的含義，其可以指"包含"、"含有" 等。本文中使用的"包含"或"包括"等指不受限制的包含或包括。
[0057] 來源于羊水之腎臟祖細(xì)朐的分離、牛長和表征
[0058]本發(fā)明涉及經(jīng)分離和純化的、來源于羊水的⑶24和OB-鈣粘蛋白陽性腎臟祖細(xì)胞 群和其分離、培養(yǎng)、分化方法以及其用途。其分離、生長和表征在下面實(shí)施例中進(jìn)行詳細(xì)描 述。
[0059]此外，在分離時(shí)和分離后，可將本發(fā)明的來源于羊水的腎臟祖細(xì)胞群培養(yǎng)于本領(lǐng) 域熟知且可由美國典型培養(yǎng)物中心（American Type Culture Colletion，ATCC)商購獲得 的培養(yǎng)基中。這樣的培養(yǎng)基包括但不限于Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)、 DMEM F12培養(yǎng)基、Eagle's Minimum Essential Medium、F_12K培養(yǎng)基、Iscove's Modified Dulbecco's Medium或RPMI-1640培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所使用細(xì)胞的需要來修 改或調(diào)整培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)基添加物的濃度。還很明顯的是，可以使用低葡萄糖配方、有或 沒有丙酮酸鈉的多種培養(yǎng)基。
[0060]還可以考慮添加含有哺乳動(dòng)物血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。血清常含有生存和增殖所需的 細(xì)胞因子和組分。血清的實(shí)例包括胎牛血清（FBS)、牛血清（BS)、小牛血清（CS)、胎小牛血 清（FCS)、新生小牛血清（NCS)、山羊血清（GS)、馬血清（HS)、人血清、雞血清、豬血清、綿羊 血清、兔血清、大鼠血清（RS)、血清替代品和牛胚胎液。應(yīng)當(dāng)理解，如果認(rèn)為需要使補(bǔ)體級(jí)聯(lián) 反應(yīng)的組分失活，則可將血清在55-65°C熱滅活。還可以調(diào)整血清濃度或者從培養(yǎng)基中去除 血清，以促進(jìn)一種或多種所期望細(xì)胞類型的存活。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述來源于羊水的 腎臟祖細(xì)胞在存在對(duì)該物種細(xì)胞類型特異性的FBS/或血清的情況下培養(yǎng)。例如，可以用約 0? 5%至約5%或者更高（包括約5%至約15% )的總血清（例如FBS)濃度使來源于羊水 的腎臟祖細(xì)胞分離和/或擴(kuò)增?？梢詰{經(jīng)驗(yàn)確定血清濃度。
[0061]還可以使用額外的添加物，從而為細(xì)胞提供用于最佳生長和增殖的微量元素。 這樣的添加物包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉及其組合。這些組分可以包含在鹽溶液 中，所述鹽溶液例如但不限于 Hanks'Balanced SaltSolution?(HBSS)、Earle's Salt Solution?、抗氧化添加劑、MCDB-201?添加劑、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)、N-2-羥乙基哌嗪-N' -乙磺酸（HEPES)、煙酰胺、抗壞血酸和/或抗壞血酸-2-磷酸酯以及 額外的氨基酸。很多細(xì)胞培養(yǎng)基已經(jīng)含有氨