一種生物催化合成光學(xué)活性烷基內(nèi)酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生物催化轉(zhuǎn)化合成光學(xué)活性 (R) - (+) -4-己基-4- 丁內(nèi)酯和（R) - (+) -5-戊基-5-戊內(nèi)酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 光學(xué)活性的手性內(nèi)酯，比如（R)-(+)_4-己基-4-丁內(nèi)酯和（R)-(+)_5-戊基-5-戊 內(nèi)酯，是重要的香料添加劑，在釀酒、食品制造等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛?；瘜W(xué)法拆分是制備高光學(xué) 純度手性內(nèi)酯的常用方法，通常的化學(xué)拆分方法一般以外消旋的手性內(nèi)酯為起始原料，在 堿性條件下水解開(kāi)環(huán)，然后進(jìn)行酯化和烷氧基衍生化生成非對(duì)映異構(gòu)體混合物，對(duì)該混合 物進(jìn)行分離，獲得單一構(gòu)型的化合物，然后再進(jìn)行水解和環(huán)化，得到光學(xué)純的手性內(nèi)酯化合 物?；瘜W(xué)拆分方法步驟繁多，分離條件苛刻，理論產(chǎn)率最高為50%，產(chǎn)品光學(xué)純度低，不利于 光學(xué)純手性內(nèi)酯化合物的高效低成本大規(guī)模制造。
[0003] 近年來(lái)，基于整細(xì)胞或酶制劑的生物催化工藝在光學(xué)活性手性化合物合成領(lǐng)域 取得了巨大成功。目前，生物催化合成光學(xué)活性烷基取代的手性內(nèi)酯仍屬于一個(gè)較新 的領(lǐng)域，許多研發(fā)工作尚處于起步階段。G6tz等利用化學(xué)-酶法組合催化合成烷基衍 生的（S) - y -戊內(nèi)酯（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97:3865 - 3873)，需要使用 兩種不同的酶組合，成本較高，并且手性取代基為較短的甲基，無(wú)法合成含長(zhǎng)鏈烷基取 代的手性內(nèi)酯。陳兵等通過(guò)內(nèi)酯酶催化合成2-羥基取代的手性烷基內(nèi)酯（Adv. Synth. Catal. 2009, 351:2959-2966 ;Chem. Commun. 2010, 46:2754 - 2756)，但對(duì) 2 位無(wú)取代的烷基 內(nèi)酯的催化合成效果不好。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、高效、低成本的生物催化較長(zhǎng)烷基取代的手性 內(nèi)酯化合物合成方法，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工藝簡(jiǎn)單，環(huán)境 友好，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景的生物催化合成光學(xué)活性烷基內(nèi)酯的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種生物催化合成光學(xué)活性烷基內(nèi) 酯的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
[0006] (1)使用生物催化劑催化羰基酸不對(duì)稱還原合成光學(xué)活性羥基酸；
[0007] ⑵在酸性環(huán)境中，使光學(xué)活性羥基酸環(huán)化生成光學(xué)活性內(nèi)酯化合物。
[0008] 所述的生物催化劑來(lái)源于近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis)，優(yōu)選的為來(lái) 源于近平滑假絲酵母CGMCC2. 3539。
[0009] 所述的生物催化劑為近平滑假絲酵母細(xì)胞；或者是將近平滑假絲酵母菌體破碎后 獲得的含有羰基還原酶的無(wú)細(xì)胞提取物。
[0010] 所述的生物催化劑可通過(guò)以下方法獲得：
[0011] ⑴靜息細(xì)胞的制備
[0012] 將近平滑假絲酵母菌CGMCC2. 3539在滅菌（121°C，20min)的豐富培養(yǎng)基（甘油 1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，瓊脂1.5% )斜面上劃線，于30°C靜置培養(yǎng)1-2天。
[0013] 取一環(huán)斜面菌種，接入種子培養(yǎng)基（甘油1 %，蛋白胨0. 5 %，牛肉膏0. 8 %，pH7. 0) 中，25-37°C培養(yǎng)24-48小時(shí)。再以該培養(yǎng)液作為種子，基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為 1-10% (v/v)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25-37°C下150-250rpm搖床上培養(yǎng)24-48小時(shí)，培養(yǎng) 結(jié)束后離心得到靜息濕細(xì)胞。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基可采用常規(guī)的培養(yǎng)基，其中各組分的含量 如下：甘油 10_50g/L，牛肉膏 l-20g/L，蛋白胨 l-20g/L，KH2P041-10g/L，Na2HP041-10g/L， NaCl 0? l-2g/L，MgS040. l-2g/L，pH 5-8。
[0014] (2)無(wú)細(xì)胞提取物的制備
[0015] 稱取收獲的濕細(xì)胞，懸浮于5~20倍體積質(zhì)量比（v/w)的緩沖液中 (50mM，pH7. 0)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。一般的，使用超聲波處理的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎，將細(xì) 胞懸浮液置于冰水浴中，超聲波功率為400W，超聲4s，間歇6s，計(jì)為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行99個(gè) 循環(huán)，將破碎液在4°C，lOOOOrpm高速離心，獲得的上清液即為無(wú)細(xì)胞提取物。
[0016] 無(wú)細(xì)胞提取物中的羰基還原酶活力測(cè)定：
[0017] 將含 2mmol/L 5-羰基癸酸和 0? lmmol/L NADPH 的 lmL 反應(yīng)體系（100mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7. 0)預(yù)熱至30°C，然后加入適量的無(wú)細(xì)胞提取物，30°C保溫反應(yīng)，在 分光光度計(jì)上檢測(cè)340nm處NADPH的吸光度變化，記錄1分鐘內(nèi)吸光度的變化值。
[0018] 按上述方法測(cè)定所述羰基還原酶的活力時(shí)，可用下式計(jì)算得到酶活力：
[0019] 酶活力（U) = EWXVX 107(6220X1)
[0020] 式中，EW為1分鐘內(nèi)340nm處吸光度的變化；V為反應(yīng)液的體積，單位為ml ;6220 為NADPH的摩爾消光系數(shù)，單位為L(zhǎng)/(mol ?〇!!) ;1為光程距離，單位為cm。1個(gè)單位（U)羰 基還原酶對(duì)應(yīng)于上述條件下每分鐘氧化1 U mol NADPH所需的酶量。
[0021] 所述的使用生物催化劑催化羰基酸不對(duì)稱還原的具體步驟為：在pH為6~8的緩 沖體系中，25~40°C條件下進(jìn)行，加入底物4-羰基癸酸或5-羰基癸酸，羰基酸濃度（底物 濃度）為1~l〇〇g/L ;反應(yīng)體系中還包含10~100g/L的葡萄糖，0~40kU/L的葡萄糖脫 氫酶和0~ImM的NADP+，反應(yīng)時(shí)間為3~12h，間歇取樣，進(jìn)行氣相色譜分析，直至產(chǎn)物濃 度不再持續(xù)上升時(shí)結(jié)束反應(yīng)，生成光學(xué)活性的羥基酸。
[0022] 所述葡萄糖脫氫酶的獲得可參考文獻(xiàn)報(bào)道，例如參見(jiàn)Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2011，38,633_641〇
[0023] 所述的生物催化劑來(lái)源于近平滑假絲酵母細(xì)胞，即為上述靜息濕細(xì)胞時(shí)，每升反 應(yīng)液的生物催化劑用量為10~l〇〇g近平滑假絲酵母細(xì)胞。
[0024] 所述的生物催化劑為含有羰基還原酶的無(wú)細(xì)胞提取物時(shí)，每升反應(yīng)液的生物催化 劑用量為4-40kU羰基還原酶。
[0025] 所述的在酸性環(huán)境中，使光學(xué)活性羥基酸環(huán)化具體步驟為：將步驟（1)所得含有 羥基酸的反應(yīng)液酸化至pH 1~2 (將反應(yīng)液酸化，通常使用20% (w/v)的硫酸），60~80°C 加熱1~2h，促使羥基酸環(huán)化生成相應(yīng)的內(nèi)酯，使用水不溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，萃取液干