性得到所述亞致死量金黃色葡萄球菌對消毒 劑的抗藥性變化；
[0017] 在測定所述亞致死量金黃色葡萄球菌對消毒劑的抗藥性變化的同時，采用K-B紙 片試驗法，分別連續(xù)觀察記錄所述三種消毒液的亞致死量1-20代的金黃色葡萄細菌對抗 生素藥敏的變化，所述抗生素為以下幾種之一：青霉素、紅霉素、萬古霉素、慶大霉素、利福 平、左氧氟沙星、頭孢西丁、SMZ-CO。
[0018] 本發(fā)明所述同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，其中，所 述步驟（4)具體包括如下步驟：
[0019] 選取經消毒劑亞致死量篩選的第20代金黃色葡萄球菌作為原代菌，用接種環(huán)蘸 取典型的菌落，接種到血液增菌肉湯管中培養(yǎng)24h為一代；用所述接種環(huán)蘸取培養(yǎng)好的血 液增菌肉湯菌懸液，接種到分離平皿中，置于35°C-37°C培養(yǎng)18-24h;用所述接種環(huán)蘸取所 述分離平皿中的典型菌落接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，35°C-37°C培養(yǎng)18-24h得到菌苔；質量 分數(shù)為3%的磷酸鹽緩沖液洗下菌苔，振蕩均勻并經無菌脫脂棉過濾制備成所述血液增菌 肉湯菌懸液；按照所述步驟（3)進行藥物敏感試驗，記錄每次藥敏結果，連續(xù)重復傳代從第 20代到第40代。
[0020] 本發(fā)明所述同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，其中，所 述亞致死量金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥性的測定具體包括如下步驟：
[0021] 分別用無菌棉簽蘸取所述1-20代亞致死量的金黃色葡萄球菌的菌懸液，在試管 內壁液面上方旋轉緊壓，將多余的菌液擠去，然后在每個M-H培養(yǎng)基平板瓊脂表面上均勻 涂抹接種3次，每次旋轉平板60°C，以確保接種菌的均勻分布，最后沿著平板內緣涂抹一 周，干燥5分鐘；然后在平板上貼放選取的直徑5_抗菌藥物紙片，使其緊貼平板表面，每個 平皿貼4張，蓋好平皿，置于35-37°C培養(yǎng)18-20h，用游標卡尺量取抑菌圈，記錄每次藥敏結 果，結果判定根據(jù)臨床微生物標準化操作；連續(xù)做20代試驗。
[0022] 本發(fā)明所述同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，其中，所 述增菌肉湯管中含有血液增菌肉湯，其組分為：蛋白胨10.〇g/L ;牛肉浸出粉3. Og/L ;氯化 鈉5. Og/L;葡萄糖1. Og/L;枸櫞酸鈉3. Og/L ;磷酸氫二鉀2g g/L;對氨基苯甲酸0. 05g/L ; 硫酸鎂2. 4g/L ;酚紅0. 024g/L ;其余為蒸餾水；血液增菌肉湯pH值為7. 4±0. 1 ;經121°C 滅菌15min和35°C 24h無菌試驗備用。
[0023] 本發(fā)明所述同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，其中，所 述步驟（3)具體包括如下步驟：是采用K-B紙片試驗法，連續(xù)觀察記錄所述三種消毒液的亞 致死量1-20代金黃色葡萄細菌的每一代對抗生素藥敏的變化，所述抗生素為以下幾種之 一：青霉素、紅霉素、萬古霉素、慶大霉素、利福平、左氧氟沙星、頭孢西丁、SMZ-C0。
[0024] 本發(fā)明方法中0?5麥氏比濁管配制方法為：0?48mol/LBacl2 (1. 17 %w/v BaCl2.2H20)溶液0. 5ml;0. 18mol/LH2S04溶液99. 5ml;將兩液混合，分置管內密封，用前混 勻；〇. 5麥氏標準：含菌量1. 5X108cfu/ml
[0025] 本發(fā)明所述亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性測定方法，執(zhí)行本發(fā)明過程 中應注意問題如下：
[0026] 各種培養(yǎng)基的排污染技術：實驗所用的營養(yǎng)肉湯管、記數(shù)平皿、營養(yǎng)瓊脂斜面，于 實驗前2天置于孵育箱內經35-37 °C培養(yǎng)48h，沒有污染可以使用；
[0027] 實驗用菌懸液的排污染技術：從斜面培養(yǎng)基洗下的菌懸液先涂片革蘭氏染色，觀 察是否為金黃色葡萄球菌，排除實驗用菌懸液的污染后，再做殺菌實驗；
[0028] 環(huán)境的排污染技術：即無菌操作技術的運用；
[0029] 實驗前把實驗用品備齊：高壓滅菌的隔離衣，使用一次性口罩和帽子、無菌手套； 同時把以下放入凈化臺內的物品先用75%酒精擦拭除塵：血液增菌肉湯管等各種培養(yǎng)基 (預培養(yǎng)的）、酒精燈、接種環(huán)、接種針、一次性注射器、無菌試管、無菌硬水、三種消毒液、小 牛血清等；
[0030] 檢查實驗設備的完好性：35-37 °C孵育箱等；
[0031] 實驗室大環(huán)境的準備：試驗在生物安全實驗室進行，每次實驗前一天清潔房間各 種表面和地面，實驗當天首先打開房間和超凈臺的紫外線消毒40分鐘以上；
[0032] 操作環(huán)境的準備：洗凈雙手，穿滅菌隔離衣，帶一次性口罩、帽子、帶無菌手套；試 驗前用75%酒精消毒擦拭超凈工作臺面；
[0033] 本發(fā)明中的殺菌和抗藥敏試驗均按照消毒技術規(guī)范操作。
[0034] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方 法具有如下有點：
[0035] 本發(fā)明將細菌的抗藥性、耐藥性和藥敏性恢復三個實驗方法巧妙結合，能夠準確、 清楚地測出三者之間的動態(tài)關系，測定結果可信度高，揭示出亞致死量消毒劑（相當于實 際工作中不規(guī)范使用消毒劑），不僅選擇出對消毒劑耐受性增加的細菌，并且選擇出的細菌 對抗生素也產生耐藥性，說明兩者之間有交叉耐藥現(xiàn)象，因此本實驗為將來的加強消毒劑 的使用管理（要像使用抗菌藥物一樣，要規(guī)范使用消毒劑，減少細菌耐藥性和抗性的產生， 延緩消毒劑和抗生素的壽命）提供理論指導。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1
[0037] 一種同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，包括如下步驟：
[0038] (1)制備含干擾劑的金黃色葡萄球菌的菌懸液；
[0039] (2)配制不同種類不同濃度的消毒劑對所述含干擾劑的金黃色葡萄球菌的菌懸液 進行殺菌試驗并測定每一代亞致死量金黃色葡萄球菌的抗藥性；同時測定所述每一代亞致 死量金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥性；連續(xù)做20代；
[0040] (3)敏感性恢復實驗：選取經消毒劑亞致死量篩選的第20代金黃色葡萄球菌作為 原代菌，接種到血液增菌肉湯管中培養(yǎng)并制備成血液增菌肉湯菌懸液，將所述血液增菌肉 湯菌懸液進行藥物敏感試驗；重復上述步驟至第40代。
[0041] (4)根據(jù)所述步驟（2)、（3)和（4)的測定結果，找出所述亞致死量金黃色葡萄球 菌對所述消毒劑的抗藥性及其對所述抗生素的耐藥性的變化規(guī)律及聯(lián)系。
[0042] 實施例2
[0043] 一種同時測定亞致死量金黃色葡萄球菌抗藥性和耐藥性的方法，包括如下步驟：
[0044] (1)將所述金黃色葡萄球菌經過增菌培養(yǎng)和分離培養(yǎng)，經分離培養(yǎng)后將所述金黃 色葡萄球菌分成單個細菌，并使其獨立分裂繁殖形成單獨菌落；用接種針挑取所述分離培 養(yǎng)得到的典型菌落接種到營養(yǎng)瓊脂斜面，在35-37°C條件下培養(yǎng)24h形成菌苔；用質量分數(shù) 為3%磷酸鹽緩沖液洗下所述菌苔，經振蕩均勻并經無菌脫脂棉過濾后得到濾液，用無菌水 稀釋所述濾液制備成濃度為〇. 5麥氏標準的菌懸液；將所述菌懸液與干擾劑溶液做對倍稀 釋配成l〇ml的濃度為7. 5X107cfu/ml含有干擾劑的菌懸液備用，所述干擾劑溶液時由成 品血清白蛋白30g和蒸餾水1000mL混勻后用0. 45ym微孔濾膜過濾除菌制備而成，所述干 擾劑溶液中牛血清蛋白的質量分數(shù)為3%;
[0045] (2)各濃度碘伏的制備：取11個無菌試管分別編號Ai-An，用注射器把編號A2~ An的試管各加入4毫升蒸餾水，取4毫升碘伏原液加入A:號試管中，所述碘伏原液中有效 碘的濃度為5000mg/l;再取4毫升所述碘伏原液加入A2號試管混勻得到A2碘伏液，其有效 碘的