專利名稱：拮抗血管新生誘導(dǎo)因子的融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及拮抗血管新生誘導(dǎo)因子的融合蛋白及其用途。具體地，本發(fā)明涉及抑制多種血管新生因子的融合蛋白及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及VEGF受體和FGF受體的融合蛋白及其在治療與血管新生相關(guān)的疾病中的用途。
背景技術(shù)：
血管新生(Angiogenesis)是導(dǎo)致惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基本要素之一 [1]。血管新生過程受多種因子的調(diào)節(jié)，有些因子促進血管新生，有些因子抑制血管新生，因而，血管新生的調(diào)控是一個十分復(fù)雜的動態(tài)平衡過程[2]?？寡苄律委熤荚谕ㄟ^阻斷血管新生刺激因子或者用血管新生抑制因子阻止腫瘤中血管的新生，從而達到控制腫瘤生長的目的。目前已經(jīng)知道相當(dāng)數(shù)目的血管新生刺激因子，例如血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)、@ 千會IfiHISi (Fibroblast growth factor, FGF)、肝細胞生長因子 Ofepatocyte growth factor, HGF)、DDRU EphAU EphA2、EphA8、 EphBl、、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A、PDGFR-B, TEK、Tie-I 等，這些因子能刺激血管內(nèi)皮細胞的分裂、分化和血管的形態(tài)發(fā)生。其中，VEGF是目前所知對血管新生最特異、最有效的生長因子[3，4]。在腫瘤組織內(nèi)的缺氧環(huán)境中，腫瘤細胞分泌大量的VEGF，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的分裂和遷移，最終建立腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)。眾多動物試驗證明，抑制VEGF能阻止血管新生，進而抑制腫瘤的生長。正因為此，VEGF及其受體是抗血管新生藥物最重要的靶標，目前在臨床試驗中取得顯著療效的抗血管新生藥物有貝伐單抗(Bevacizumab，商品名Avastin)，它能夠直接阻斷VEGF，抑制腫瘤血管的新生，于2004年被美國FDA批準上市作為結(jié)直腸癌的一線用藥，是第一個被批準上市的通過抑制血管新生發(fā)揮抗癌作用的新藥。Avastin是一種人源化的抗VEGF的單克隆抗體，由美國著名生物技術(shù)公司Genentech生產(chǎn)。在大規(guī)模三期臨床試驗中，Avastin與化療聯(lián)合用藥可以顯著延長多種腫瘤病人的生存時間，包括直腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌等[5，6]。Avastin在臨床上的成功具有劃時代的意義，它證明以腫瘤血管系統(tǒng)為靶標的抗血管新生治療是一個在臨床上有效的治療手段，為多種腫瘤的治療開辟了一個全新的途徑。在西方國家，Avastin已在腫瘤治療上得到廣泛應(yīng)用，是目前全球銷售額最大的藥物之一。除了 Avastin，還有若干個抗VEGF信號的藥物正處于人體臨床試驗的后期，有望在將來幾年進入臨床應(yīng)用。其中，美國生物技術(shù)公司Regeneron和Sanofi-Aventis合作的 Afliberc印t (或稱VEGF-Trap)目前正在進行大規(guī)模第三期臨床試驗[7]。Imclone公司的抗VEGF受體II (VEGFR2)單克隆抗體藥物IMC-1121B也在第三期臨床試驗[8]。毫無疑問，這些新藥將為癌癥的治療提供新的選擇，給病人帶來新的希望。抗VEGF藥物在腫瘤的臨床治療上取得了重大的進展，但是，臨床試驗也顯示抗 VEGF治療也存在相當(dāng)大的局限。從腫瘤的治療效果看，Avastin對直腸結(jié)腸癌病人能延長半數(shù)生存時間約3-4個月[9，10]，對乳腺癌病人能延長半數(shù)生存時間約為7-8個月[11]，因此，Avastin并不能長期有效地抑制腫瘤血管的生長。因此，如何進一步提高抗血管新生的臨床治療效果是腫瘤研究者需要解決的問題，也是研究開發(fā)下一代抗血管新生藥物的重
點ο導(dǎo)致抗VEGF治療失敗或產(chǎn)生抗性的的根本原因可能在于腫瘤血管新生是受到多種因子控制的，盡管VEGF在血管新生中起到重要作用，但它不是唯一的血管新生刺激因子。同時，由于腫瘤細胞的非均質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性以及機體的代償性反應(yīng)機制，當(dāng) VEGF的活性被長時間抑制，其它血管新生刺激因子便會被表達[12]，從而使腫瘤血管的生長不再依賴于VEGF信號途徑。Hanahan的小組研究了胰島腫瘤在接受抗VEGFR2治療過程中腫瘤表達血管生長因子的變化，發(fā)現(xiàn)在抗VEGF的治療過程中有若干基因的表達發(fā)生了變化，其中最為突出的是FGF-2的表達顯著增加，研究表明對抗VEGF治療出現(xiàn)耐受的腫瘤中FGF，尤其是FGF-2的表達顯著增加，從而再次激活血管新生，而阻斷FGF信號途徑后腫瘤再生則被抑制[13]。由此可見FGF-2的過度表達與腫瘤獲得逃逸抗VEGF治療的能力有著密切的關(guān)系。因此，同時抑制VEGF和FGF-2將可以更有效地治療腫瘤等血管增生性疾病。目前小分子藥物在雙重或多重靶標拮抗方面已經(jīng)取得了一定的進展，證明同時拮抗VEGF和FGF-2的抗腫瘤效果要優(yōu)于單一靶向抗腫瘤治療[14]。但是小分子多靶標拮抗劑由于缺乏特異性，往往造成難以預(yù)測的副作用，這種副作用有時要在臨床試驗后期才顯現(xiàn)，因此具有很大的風(fēng)險。而大分子蛋白藥物，尤其是Fc融合蛋白和單克隆抗體，具有特異性強、體內(nèi)半衰期長等優(yōu)點，是藥物研發(fā)的重點領(lǐng)域，具有小分子藥物不具有的優(yōu)點。成纖維細胞生長因子(FGF)是結(jié)合肝素的生長因子家族，在哺乳動物中其具有22 個家族成員(FGF 1-14，16-23)。FGF在多種生物學(xué)功能上具有重要作用，例如細胞增殖、分化、遷移、血管新生和腫瘤發(fā)生。其通過結(jié)合并活化細胞表面FGF受體(FGFR)發(fā)揮其多種生物學(xué)功能。(參見,例如 Eswarakumar et al. Cytokine Growth Factor Rev. 16 139—149， 2005)。成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)是與成纖維細胞生長因子家族成員相結(jié)合的受體。成纖維細胞生長因子受體中的一部分參與疾病過程。哺乳動物中有四個FGFR基因fgfRl-fgfR4。成纖維細胞生長因子受體由胞外區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。FGFR家族成員中，其配體結(jié)合性質(zhì)和激酶結(jié)構(gòu)域各有不同，但是都具有相似的胞外區(qū)。它們的胞外區(qū)包含三個免疫球蛋白樣(Ig樣)結(jié)構(gòu)域第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域、第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和第三Ig樣結(jié)構(gòu)域，在第一和第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域之間還包含一段序列，在本文中，我們將所述第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域和第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的序列稱為FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)。所述中間功能性序列區(qū)包含一個酸性氨基酸區(qū)段，稱為酸性盒 (acidic box, AB)0鑒于VEGF和FGF (尤其是FGF-2)在腫瘤血管新生中的重要作用，我們認為雙重拮抗VEGF和FGF (尤其是FGF-幻的大分子蛋白藥物將能夠更好地抑制腫瘤血管的新生，在臨床上得到更好的治療效果。但到目前為止，尚未有成功構(gòu)建對VEGF和FGF具有雙重阻斷作用的大分子融合蛋白的報道。因此，本研究旨在探索構(gòu)建一種能同時拮抗VEGF和FGF(尤其是FGF-2)的Fc融合蛋白，該融合蛋白利用受體的特異性和高親和力，將能同時阻斷VEGF 和FGF信號。本研究的VEGF和FGF雙重拮抗融合蛋白質(zhì)將采用全人源的蛋白質(zhì)序列，結(jié)合Fc融合蛋白優(yōu)良的藥物動力學(xué)特性，將具有良好的成藥條件和臨床應(yīng)用的潛力。另一方面，在雙靶標融合蛋白中，融合蛋白對各靶標的親和力有賴于正確的蛋白質(zhì)構(gòu)型，受體片段在融合蛋白中往往失去與配體結(jié)合能力，因此，構(gòu)建高效、特異的雙重拮抗VEGF和FGF(例如FGF-2)的融合蛋白藥物具有一定的難度。在本研究的前期工作中，我們構(gòu)建了二十幾個包含不同的VEGFR片段、FGFR片段和IgGl Fc的融合蛋白，獲得了對VEGF和FGF(尤其是 FGF-2)具有高度親和力的融合蛋白。已有報道多種抑制血管新生的融合蛋白，例如基于FGFR的融合蛋白 (W0/2008/065543)、基于 Notch3 的融合蛋白(W0/2010/021729)、基于 VEGFR 的融合蛋白 (TO/2010/105573)、基于LK8的融合蛋白(W0/2008/075833)，等等，但是這些融合蛋白都是針對單一的靶標將來自單個血管新生抑制劑的部分與免疫球蛋白的Fc片段融合來實現(xiàn)抑制血管新生。現(xiàn)有技術(shù)中尚未有報道能夠成功地將兩個血管抑制單元融合在一起通過抑制雙重靶標實現(xiàn)抑制血管新生功能的融合蛋白。本發(fā)明人首次成功地將衍生自至少兩種血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元融合在一起，形成了抑制雙重靶標進而抑制血管新生的融合蛋白，出人意料地獲得了特別好的效果。因此，本發(fā)明為抑制血管新生的藥物的開發(fā)，提供了新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其包含衍生自至少兩種血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元。在一個實施方案中，所述融合蛋白抑制血管新生。在另一個實施方案中，所述融合蛋白在體內(nèi)和/或在體外結(jié)合FGF和VEGF。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含衍生自至少兩種血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元，所述至少兩種血管新生抑制劑選自VEGFR例如VEGFR1、 VEGFR2、VEGFR3，和FGFR例如FGFR1、FGFR2、FGFR4。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白包含衍生自 VEGFRU VEGFR2和FGFRl的至少兩個血管新生抑制單元。更優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白包含衍生自VEGFRl、VEGFR2和FGFRl的兩個血管新生抑制單元，其中一個血管新生抑制單元衍生自VEGFRl和VEGFR2，另一個衍生自FGFRl。在另一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含衍生自至少兩種血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元，所述至少兩種血管新生抑制劑是抑制血管新生的可溶性受體片段，所述可溶性受體片段例如可以選自DDR1、EphAl、EphA2、EphA8、EphBl、EphB4、EGFR、 HER-2、ErbR3、FGFR1、FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A, PDGFR-B,TEK,Tie-U HGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3及其等位基因變體。在一個具體實施方案中，所述血管新生抑制劑是抑制血管新生的受體VEGFR和FGFR。在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含衍生自至少兩種(優(yōu)選兩種或三種) 血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元，所述至少兩個血管新生抑制單元包括至少一個衍生自VEGFR胞外區(qū)的血管新生抑制單元和至少一個衍生自FGFR胞外區(qū)的血管新生抑制單元，優(yōu)選地所述VEGFR胞外區(qū)是VEGFR1、VEGFR2和/或VEGFR3胞外區(qū)，所述FGFR胞外區(qū)是FGFRl和/或FGFR2胞外區(qū)。在另一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含衍生自至少兩種(優(yōu)選兩種或三種)血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元，其中所述至少兩個血管新生抑制單元包括一個衍生自VEGFRl和/或VEGFR2胞外區(qū)的血管新生抑制單元和一個衍生自FGFRl胞外區(qū)的血管新生抑制單元。
7
在又一些實施方案中，所述衍生自VEGFR(如VEGFRl和/或VEGFR2)胞外區(qū)的部分包含選自下列的一項或多項或者由其組成VEGFR(如VEGFRl或VEGFR2)的第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFR(如VEGFRl或VEGFR2)第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFR(如 VEGFRl或VEGFR2)第三Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFR(如VEGFRl或VEGFR2)第四Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFR(如VEGFRl或VEGFR2)第五Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFR(如 VEGFRl或VEGFR2)第六Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分和VEGFR (如VEGFRl或VEGFR2)第七Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分。在又一些實施方案中，所述衍生自FGFR(如FGFR1)胞外區(qū)的部分包含選自下列的一項或多項或者由其組成FGFR(如FGFR1)第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、源自FGFR(如 FGFR1) Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR(如FGFR1)第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分和FGFR(如FGFR1)第三Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分。特別地，本發(fā)明的融合蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域和/或區(qū)段等之間可以直接連接和/或通過接頭連接。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含所述源自FGFR(如FGFRl)Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分；優(yōu)選地，所述源自FGFR (如FGFR1) Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分不包含酸性盒(acidic box, AB) 0在一個具體實施方案中，所述源自中間功能性序列區(qū)的部分具有選自以下的序列與SEQ ID NO 1第134至162位、145至162位或151至162位對應(yīng)的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分包含=VEGFRl或VEGFR2的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和VEGFRl或VEGFR2的第三Ig樣結(jié)構(gòu)域；所述衍生自FGFR (如FGFR1)胞外區(qū)的部分包含源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和 FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分不包含酸性盒。特別地，所述FGFR例如是FGFRl或FGFR2。在另一個實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分包含=VEGFRl的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和VEGFR2的第三Ig樣結(jié)構(gòu)域；所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分包含源自FGFR Ig 樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分不包含酸性盒。特別地，所述FGFR 例如是FGFRl或FGFR2。在又一個實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分從N端到C端依次包含 VEGFRl的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和VEGFR2的第三Ig樣結(jié)構(gòu)域；所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分從N端到C端依次包含源自FGFRIg樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分不包含酸性盒。特別地，所述FGFR例如是FGFRl或FGFR2。在一些具體實施方案中，所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分還包含VEGFRl第一 Ig 樣結(jié)構(gòu)域。例如，所述VEGFRl第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域是在VEGFRl第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域之前。優(yōu)選地，VEGFRl第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO :2第32至123位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :2第32至123位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、 93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在另一些實施方案中，所述衍生自FGFR (如FGFR1)胞外區(qū)的部分還包含F(xiàn)GFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分。優(yōu)選地，F(xiàn)GFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分具有與SEQ ID NO 1第40至118位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第40至118位的序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列；
或者與SEQ ID NO :1第77至118位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第77 至118位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98% 或99%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，VEGFRl第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 2 第151至214位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 2第151至214位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實施方案中，VEGFR2第三Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 3第2M至320位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 3第2M至320位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的又一些優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)GFRl第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 1第163至247位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第163至247位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的再一些優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)GFRl第三Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 1第270至359位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ IDNO :1第270至359位的氨基酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白還包含融合伴侶，例如免疫球蛋白Fc區(qū)，優(yōu)選人IgG Fc區(qū)，更優(yōu)選地是人IgGl Fc區(qū)，再優(yōu)選地其具有與SEQ ID NO 7相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 7的氨基酸序列有至少 70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列； 或者與SEQ ID NO 8相對應(yīng)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 8 的核苷酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。在又一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白還包含分泌信號肽區(qū)，例如VEGFRl信號肽區(qū)，優(yōu)選地所述分泌信號肽區(qū)具有SEQ ID NO :2第立的氨基酸序列或者SEQ ID NO 25的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。在又一個方面，本發(fā)明提供了 Fc融合蛋白，所述蛋白包含(1)由與SEQ ID NO 9~24任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選地至少 80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99% 同一性；(2)由與SEQ ID NO :26_41任一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，優(yōu)選地至少80 %、90 %、93 %、95 %、97 %、98 %或99 %同一性；或
者(3) SEQ ID NO 9~24任一項所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO :26-41任一項所示
9核苷酸序列編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明的一些實施方案中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白中所包含的各部分和/或各個結(jié)構(gòu)域從N端到C端的順序可以是任意的，或者也可以是圖1所示的順序。在一些實施方案中，本發(fā)明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白還包含信號肽(signal peptide, SP)，優(yōu)選分泌信號肽，例如VEGFRl的信號肽，其具有SEQ ID NO :2第1至沈位的氨基酸序列或者SEQ ID NO :25的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。優(yōu)選地，信號肽在所述融合蛋白的N端。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白從N端到C端依次包含衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分和衍生自FGFR胞外區(qū)的部分。優(yōu)選地，在本發(fā)明的融合蛋白中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)是人IgG Fc區(qū)，例如人 IgGl Fc區(qū)，更優(yōu)選地其具有與SEQ ID NO 7相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 7的氨基酸序列有至少 70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列； 或者與SEQ ID NO 8相對應(yīng)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO 8 的核苷酸序列有至少70%同一性，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)位于融合蛋白的C端。在本發(fā)明的一些實施方案中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白中所包含的各區(qū)域和/或各個結(jié)構(gòu)域從N端到C端的順序可以是任意的。在另一些實施方案中，所述順序可以是圖 1所示的順序。在一些具體實施方案中，從N端向C端，VEGFR部分和FGFR部分可以分別位于對方的上游或下游。此外，所述Fc區(qū)可以位于血管新生抑制單元的上游或下游；例如所述Fc區(qū)位于融合蛋白的C端區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白還包含一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵，優(yōu)選在Ig樣結(jié)構(gòu)域中包含一個或多個鏈內(nèi)二硫鍵。在本發(fā)明的一個方面中，VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白可通過在原核細胞或真核細胞例如細菌、真菌(如酵母)或哺乳動物細胞系中表達本發(fā)明的融合蛋白來產(chǎn)生。特別地，所述哺乳動物細胞系可以是CHO細胞系。在重組蛋白質(zhì)表達方面，CHO細胞是經(jīng)常使用的細胞系。而且，還基于大規(guī)模表達中多方面的需要改造了原始CHO細胞，從而得到了一系列針對特定表達目的的用于重組蛋白生產(chǎn)的衍生CHO細胞系，例如用于無血清培養(yǎng)等。這些都是在重組蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域公知的。在又一個方面，本發(fā)明的融合蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域和/或區(qū)域之間直接連接和/ 或通過接頭連接，例如衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分、衍生自FGn 胞外區(qū)的部分和衍生自免疫球蛋白Fc區(qū)的部分通過或不通過接頭融合。在一個實施方案中，衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分、衍生自FGFR胞外區(qū)的區(qū)域和免疫球蛋白Fc區(qū)直接連接。在另一個實施方案中，衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分、衍生自FGFR胞外區(qū)的區(qū)域和免疫球蛋白Fc區(qū)通過接頭連接，例如通過(G4S)3接頭相連。另一方面，本發(fā)明涉及編碼所述融合蛋白的分離的核酸分子。優(yōu)選地，所述核酸分子包含SEQ ID NO :26-41任一項所示核苷酸序列。
又一方面，本發(fā)明提供了包含所述核酸分子的載體。還提供了用所述載體轉(zhuǎn)化/ 轉(zhuǎn)染的細胞，優(yōu)選CHO細胞。再一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的融合蛋白、核酸分子、 載體或細胞，以及可藥用載體。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通過在原核細胞或真核細胞例如細菌、真菌(如酵母)或哺乳動物細胞系中表達本發(fā)明的融合蛋白來進行。優(yōu)選地，所述哺乳動物細胞系是CHO細胞系。在另一個方面中，本發(fā)明提供了抑制血管新生的方法，其包括向有此需要的對象施用抑制血管新生有效量的本發(fā)明融合蛋白、核酸分子、載體、細胞或藥物組合物。優(yōu)選地，所述方法在哺乳動物中進行。在又一個方面中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療或預(yù)防腫瘤的方法，其包括向有此需要的對象施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明融合蛋白、核酸分子、載體、細胞或藥物組合物，優(yōu)選地所述腫瘤是實體瘤。在又一個方面中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中治療或預(yù)防眼科血管新生相關(guān)疾病的方法，其包括向有此需要的對象施用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明融合蛋白、核酸分子、載體、細胞或藥物組合物，優(yōu)選地所述眼科血管新生相關(guān)疾病選自年齡相關(guān)黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等。在另一方面，本發(fā)明提供了一種在體外或在體內(nèi)結(jié)合FGF和/或VEGF的方法，其包括使FGF和VEGF與本發(fā)明的融合蛋白相接觸。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的融合蛋白、編碼其的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、 用所述載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細胞或者包含它們的藥物組合物在制備用于抑制血管新生的藥物中的用途。另外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的融合蛋白、編碼其的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的細胞或者包含它們的藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防血管新生相關(guān)疾病的藥物中的用途，優(yōu)選地所述血管新生相關(guān)疾病是腫瘤或者眼中血管新生相關(guān)疾病?？紤]到不同國家的專利制度對保護主題有不同規(guī)定，本公開內(nèi)容還提供與以上方法相對應(yīng)的制藥用途以及用于預(yù)定用途的藥物。這些各種制藥用途和藥物也在本發(fā)明保護范圍內(nèi)，就像它們已經(jīng)具體記載在本公開內(nèi)容中一樣。本公開內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本公開內(nèi)容中具體記載一樣。將結(jié)合附圖以及以下進一步的詳細說明來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。 本發(fā)明的保護范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準。


圖1是VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，其中VEGFRl、VEGFR2、FGFRl蛋白分別列出。Fc融合蛋白以實線表示，缺失的氨基酸以虛線表示；抗體樣結(jié)構(gòu)域用環(huán)型表示；不
11同的抗體樣結(jié)構(gòu)域以字母+數(shù)字表示，其中VEGFRl的結(jié)構(gòu)域以al_a7表示，VEGFR2的結(jié)構(gòu)域以bl-b7表示，F(xiàn)GFRl的結(jié)構(gòu)域以cl-c3表示；二硫鍵以ss表示；人IgGl Fc用灰色框表示；SP表示信號肽；(G4Q 3連接序列以三個黑色菱形框表示；酸性盒序列以帶AB字母的方框表示。 圖2是不同F(xiàn)c融合蛋白結(jié)合VEGF和FGF-2比較圖，其中通過ELISA法檢測各Fc 融合蛋白OOng/mL)與包被的VEGF165和/或FGF-2(含100ng/mL Heparin)的結(jié)合情況。
圖3顯示了融合蛋白的SDS-PAGE圖。圖4顯示了融合蛋白梯度與VEGF(A)和FGF-2 (B)的結(jié)合。圖5顯示了融合蛋白與VEGF (A)和FGF-2 (B)的親和力。圖6顯示了融合蛋白對VEGF或FGF-2誘導(dǎo)的HUVEC細胞分裂的影響及其相對抑制率。其中圖A為融合蛋白對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細胞增殖的影響，圖B為融合蛋白對VEGF 誘導(dǎo)的HUVEC細胞增殖的相對抑制率，圖C為融合蛋白對FGF2誘導(dǎo)的HUVEC細胞增殖的影響，圖D為融合蛋白對FGF2誘導(dǎo)的HUVEC細胞增殖的相對抑制率。
具體實施例方式
定義除非另有定義，本文使用的所有科技術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的相同含義。關(guān)于本領(lǐng)域的定義及術(shù)語，專業(yè)人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。盡管本發(fā)明的廣義范圍所示的數(shù)字范圍和參數(shù)近似值，但是具體實施例中所示的數(shù)值盡可能準確的進行記載。然而，任何數(shù)值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包含的任何和所有子范圍。例如記載的“1至10”的范圍應(yīng)認為包含最小值1和最大值10之間(包含端點)的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子范圍，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小終止的子范圍，例如5. 5至10。另外，任何稱為“并入本文”的參考文獻應(yīng)理解為以其整體并入。另外應(yīng)注意，如本說明書中所使用的，單數(shù)形式包括其所指對象的復(fù)數(shù)形式，除非清楚且明確的限于一個所指對象。術(shù)語“或”可與術(shù)語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。本文使用的術(shù)語“Fc”、“Fc區(qū)”、“Fe片段”或“免疫球蛋白Fc區(qū)”等表示免疫球蛋白的可結(jié)晶片段，在本發(fā)明中，所述Fc區(qū)優(yōu)選人IgGl的Fc區(qū)。術(shù)語“Fe融合蛋白”指將異源蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子功能相結(jié)合的抗體樣分子。從結(jié)構(gòu)上來說，F(xiàn)c融合蛋白包含具有所需結(jié)合特異性的氨基酸序列以及免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。Fc融合蛋白分子通常包含受體或配體的結(jié)合位點。所述免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列可以獲得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3 或 IgG-4 亞型，IgA(包括 IgA-I 和 IgA-2)，IgE, IgD 或 IgM0本文使用的術(shù)語“可溶性”蛋白是指在生物學(xué)相關(guān)的溫度、pH水平和滲透壓下可溶于水溶液的蛋白。本文使用的“可溶性融合蛋白”表示該融合蛋白不包含跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。如本文所用，術(shù)語“分離的”是指以下物質(zhì)和/或?qū)嶓w，(1)與起初產(chǎn)生時(在天然環(huán)境中和/或在試驗設(shè)置中)和其相關(guān)聯(lián)的至少一些組分相分離和/或( 通過人工生產(chǎn)、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、 約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、約 98%、約 99%、基本 100%或 100% 的其初始相關(guān)聯(lián)的其他組分相分離。術(shù)語“部分”和“片段”可互換的指代多肽、核酸或其它分子構(gòu)建物的一部分。本文使用的術(shù)語“VEGFR”是指血管內(nèi)皮生長因子受體，其可以是VEGFRl、VEGFR2 和/或VEGFR3。優(yōu)選地，本發(fā)明中的VEGFR是VEGFRl和/或VEGFR2，優(yōu)選人的VEGFR。本文使用的術(shù)語“FGFR”是指成纖維細胞生長因子受體，其可以是FGFR1、FGFR2、 FGFR3和/或FGFR4。優(yōu)選地，本發(fā)明中的FGFR是FGFRl，更優(yōu)選人FGFRl。本文使用的術(shù)語“Ig樣結(jié)構(gòu)域”表示免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，其可見于多種蛋白質(zhì)家族，參與多種生物學(xué)功能，包括細胞-細胞識別、細胞表面受體、免疫功能等等。本文使用的術(shù)語“VEGFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域”表示VEGFR蛋白中自N端起第一個Ig 樣結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選VEGFRl蛋白自N端起第一個Ig樣結(jié)構(gòu)域(本文稱為VEGFRl第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域)或VEGFR2蛋白自N端起第一個Ig樣結(jié)構(gòu)域(本文稱為VEGFR2第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域)，具有例如SEQ ID NO :2第32至123或SEQ ID NO :3第46至110位的氨基酸序列。類似地， VEGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有例如SEQ ID NO :2第151至214位或SEQ ID NO :3第141至 207位的氨基酸序列，VEGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域具有例如SEQ ID NO :2第230至327位或SEQ ID NO 3第2 至320位的氨基酸序列，VEGFR第四Ig樣結(jié)構(gòu)域具有例如SEQ ID NO 2第 335至421位或SEQ ID NO 3第3 至414位的氨基酸序列，VEGFR第五Ig樣結(jié)構(gòu)域例如具有SEQ ID NO 2第似8至553位或SEQ ID NO 3第421至548位的氨基酸序列，VEGFR 第六Ig樣結(jié)構(gòu)域具有例如SEQ ID NO 2第556至6 位或SEQ ID NO 3第551至660位的氨基酸序列，VEGFR第七Ig樣結(jié)構(gòu)域具有例如SEQ ID NO 2第661至747位或SEQ ID NO :3第667至753位的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述VEGFR可以是VEGFRl或VEGFR2。本文使用的術(shù)語“FGFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域”或“FGFR1第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域”表示FGFR 或FGFRl蛋白中自N端起第一個Ig樣結(jié)構(gòu)域，其具有例如SEQ ID NO :1第40至118位的氨基酸序列。類似地，術(shù)語“FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域”或“第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域”表示FGFR蛋白中自N端起第二個Ig樣結(jié)構(gòu)域，其具有例如SEQ ID NO :1第163至247位的氨基酸序列； 術(shù)語“FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域”或“第三Ig樣結(jié)構(gòu)域”表示FGFR蛋白中自N端起第一個Ig 樣結(jié)構(gòu)域，其具有例如SEQ ID NO 1第270至359位的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述FGFR是 FGFRl，F(xiàn)GFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域是FGFRl第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)GFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域是FGFRl 第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)GFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域是FGFRl第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語“FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)”或“中間功能性序列區(qū)，， 表示FGFR蛋白中第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域和第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域之間的序列，優(yōu)選地，IFS序列具有對應(yīng)于SEQ ID NO :1第118至162位的氨基酸序列。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，所述中間功能性序列區(qū)對于Ig樣結(jié)構(gòu)域的功能具有顯著的影響。所述FGFR蛋白優(yōu)選FGFRl (SEQ ID NO :1)，特別是人FGFRl蛋白。人FGFRl蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID N0:1，其cDNA序列參見 SEQ ID NO :4ο
下面給出hFGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結(jié)構(gòu)域，可參見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/AAH15035. 1MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVE
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LEERFGFRl的氨基酸序列參見SEQ ID NO :1，其編碼核苷酸序列參見SEQ ID NO :4。下面給出hVEGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域之間為天然連接序列，可參見http//www, uniprot. org/uniprot/P17948 SKLKD
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權(quán)利要求
1.抑制血管新生的融合蛋白，其包含衍生自至少兩種血管新生抑制劑的至少兩個血管新生抑制單元。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白，其包含衍生自兩種或兩種以上血管新生抑制劑的兩個血管新生抑制單元。
3.權(quán)利要求1或2的融合蛋白，其中所述血管新生抑制劑是抑制血管新生的受體，所述受體例如可以選自DDR1、EphAl、EphA2、EphA8、EphBl、EphB4、EGFR、HER-2、ErbB3、FGFRl、 FGFR2、FGFR4、MET、RON、CSF1R、KIT、PDGFR-A, PDGFR-B, TEK, Tie-U HGF, VEGFRl、VEGFR2、 VEGFR3。
4.前述任一項權(quán)利要求的融合蛋白，其中所述至少兩個血管新生抑制單元包括至少一個衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分和至少一個衍生自FGFR胞外區(qū)的部分，優(yōu)選地所述VEGFR胞外區(qū)是VEGFRl、VEGFR2和/或VEGFR3胞外區(qū)，所述FGFR胞外區(qū)是FGFRl和/或FGFR2胞外區(qū)。
5.前述任一項權(quán)利要求的融合蛋白，其中所述至少兩個血管新生抑制單元包括一個衍生自VEGFRl和/或VEGFR2胞外區(qū)的部分和一個衍生自FGFRl和/或FGFR2胞外區(qū)的部分。
6.權(quán)利要求4或5的融合蛋白，所述衍生自VEGFRl和/或VEGFR2胞外區(qū)的部分包含選自下列的一項或多項VEGFR1或VEGFR2的第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFRl或VEGFR2 第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFRl或VEGFR2第三Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFRl或 VEGFR2第四Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、VEGFRl或VEGFR2第五Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、 VEGFRl或VEGFR2第六Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、和VEGFRl或VEGFR2第七Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分。
7.權(quán)利要求4或5的融合蛋白，所述衍生自FGn 胞外區(qū)的部分包含選自下列的一項或多項FGFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分、源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分和FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分。
8.權(quán)利要求4或5的融合蛋白，其中所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分包含=VEGFRl或 VEGFR2的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和VEGFRl或VEGFR2的第三Ig樣結(jié)構(gòu)域；所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分包含源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求4-8任一項的融合蛋白，其中所述融合蛋白從N端到C端依次包含衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分和衍生自FGFR胞外區(qū)的部分。
10.權(quán)利要求9的融合蛋白，其中所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分從N端到C端依次包含VEGFR1或VEGFR2的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和VEGFRl或VEGFR2的第三Ig樣結(jié)構(gòu)域；所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分從N端到C端依次包含源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求9或10的融合蛋白，其中所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分還包含VEGFRl 或VEGFR2的第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域；優(yōu)選地，所述衍生自VEGFR胞外區(qū)的部分從N端到C端依次包含VEGFRl或VEGFR2的第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域、VEGFRl或VEGFR2的第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和VEGFRl 或VEGFR2的第三Ig樣結(jié)構(gòu)域；所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分從N端到C端依次包含源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分、FGFR第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域和FGFR第三Ig樣結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求9-11任一項的融合蛋白，其中所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分還包含 FGFR第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分。
13.權(quán)利要求9或10的融合蛋白，其中所述VEGFRl第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 2第151至214位相對應(yīng)的氨基酸序列，所述VEGFR2第三Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 3第2M至320位相對應(yīng)的氨基酸序列，所述FGFRl第二 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO 1第163至247位相對應(yīng)的氨基酸序列，和所述FGFRl第三Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO :1第270至359位相對應(yīng)的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求11的融合蛋白，其中VEGFRl第一 Ig樣結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO :2第32至123位相對應(yīng)的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求12的融合蛋白，其中FGFR第一Ig樣結(jié)構(gòu)域或其一部分具有與SEQ ID NO :1第40至118位相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :1第77至118位相對應(yīng)的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求4-15中任一項的融合蛋白，其中所述衍生自FGFR胞外區(qū)的部分包含源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分，優(yōu)選所述源自FGFR Ig樣結(jié)構(gòu)域中間功能性序列區(qū)的部分不包含酸性盒。
17.前述任一項權(quán)利要求的融合蛋白，其還包含融合伴侶，例如免疫球蛋白Fc區(qū)，優(yōu)選地是人IgG Fc區(qū)，例如人IgGl Fc區(qū)，更優(yōu)選地其具有與SEQ ID NO 7相對應(yīng)的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO :8相對應(yīng)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。
18.前述任一項權(quán)利要求的融合蛋白，所述蛋白包含(1)SEQID NO :9- 任一項所示氨基酸序列，或由SEQ ID NO :26-41任一項所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列；(2)與SEQID NO :9- 任一項所示氨基酸序列有至少70%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選地至少 80%、90%、93%、95%、97%、98%或 99% 同一性；或者(3)由與SEQID NO :26-41任一項所示核苷酸序列有至少70%同一性的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，優(yōu)選地至少80%、90%、93%、95%、97%、98%或99%同一性。
19.前述任一項權(quán)利要求的融合蛋白，其還包含分泌信號肽區(qū)，例如VEGFRl信號肽區(qū)， 優(yōu)選地所述分泌信號肽區(qū)具有SEQ ID NO :2第1至沈位的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 25所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
20.編碼前述任一項權(quán)利要求的融合蛋白的分離的核酸分子。
21.權(quán)利要求20的核酸分子，其包含SEQID NO :26-41任一項所示核苷酸序列。
22.包含權(quán)利要求20或21的核酸分子的載體。
23.用權(quán)利要求22的載體轉(zhuǎn)染的細胞，優(yōu)選CHO細胞。
24.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白、權(quán)利要求20或21的核酸分子、權(quán)利要求22的載體或權(quán)利要求23的細胞，以及可藥用載體。
25.—種生產(chǎn)抑制血管新生的融合蛋白的方法，其通過在原核細胞或真核細胞例如細菌、酵母或哺乳動物細胞系中表達權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白來進行。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述哺乳動物細胞系是CHO細胞系。
27.權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白、權(quán)利要求20或21的核酸分子、權(quán)利要求22的載體、權(quán)利要求23的細胞或權(quán)利要求M的藥物組合物在制備用于在哺乳動物中抑制血管新生的藥物中的用途。
28.權(quán)利要求1-19任一項的融合蛋白、權(quán)利要求20或21的核酸分子、權(quán)利要求22的載體、權(quán)利要求23的細胞或權(quán)利要求M的藥物組合物在制備用于治療或預(yù)防腫瘤和/或眼科血管新生性疾病的藥物中的用途，優(yōu)選地所述腫瘤是實體瘤，所述眼科血管新生性疾病選自年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制血管新生的融合蛋白及其用途。具體地，本發(fā)明涉及抑制多種血管新生因子的融合蛋白及其用途。更具體地，本發(fā)明涉及VEGF受體和FGF受體的融合蛋白及其在治療與血管新生調(diào)控相關(guān)的疾病中的用途。
文檔編號C12N5/10GK102219859SQ201110131029
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者房健民, 李棟 申請人:煙臺榮昌生物工程有限公司