測(cè)定實(shí)時(shí)pcr循環(huán)閾值的通用方法
【專利說(shuō)明】測(cè)定實(shí)時(shí)PCR循環(huán)閾值的通用方法
[0001] 背景 本公開總體涉及用于處理代表S形或生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)的系統(tǒng)和方法，并且更具體地 涉及用于確定實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增曲線中的特征性循環(huán)閾值（Ct)或彎頭值 (elbow value)或其他生長(zhǎng)曲線中的彎頭值的系統(tǒng)和方法。
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用于酶促合成或擴(kuò)增定義核酸序列的體外方法。所述反應(yīng)通常 使用兩個(gè)寡核苷酸引物，其與相反鏈雜交且側(cè)接待擴(kuò)增的模板或目標(biāo)DNA序列。引物的延 伸由熱穩(wěn)定的DNA聚合酶催化。涉及模板變性、引物退火和由聚合酶延伸退火引物的重復(fù) 系列的循環(huán)導(dǎo)致特定DNA片斷的指數(shù)累積。熒光探針或標(biāo)記通常用于過(guò)程中，以便于擴(kuò)增 過(guò)程的檢測(cè)和定量。
[0003] 具體而言，同質(zhì)（homogeneous)且在擴(kuò)增開始或物理采樣反應(yīng)用于分析后不需要 添加試劑的熒光技術(shù)是有吸引力的。示例性同質(zhì)技術(shù)使用定位目標(biāo)區(qū)域的寡核苷酸引物和 用于生成信號(hào)的熒光標(biāo)記或染料。典型的基于PCR的方法使用具有兩個(gè)相互作用的發(fā)色團(tuán) 的FRET寡核苷酸探針（相鄰的雜交探針，TaqMan探針，分子信標(biāo)，Scorpions)，只具有一 個(gè)焚光團(tuán)的單一寡核苷酸探針（G-猝滅探針，Crockett, A. 0· *C.T.Wittwer，Anal. Biochem. 2001; 290:89-97 和 SimpleProbes, Idaho Technology)，和使用 dsDNA染料（例 如，SYBR Green I)取代共價(jià)的、熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針的技術(shù)。PCR中結(jié)合所有雙鏈 (ds) DNA的DNA結(jié)合染料引起結(jié)合后染料的熒光。因此，PCR過(guò)程中DNA產(chǎn)物的增加因此導(dǎo) 致熒光強(qiáng)度的增加，并且在每個(gè)循環(huán)測(cè)量，從而允許DNA濃度得到定量。然而，一個(gè)潛在的 缺點(diǎn)是與所有dsDNA PCR產(chǎn)物的非特異性結(jié)合，這影響精確定量。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)稀釋，PCR中的 dsDNA濃度可以得到測(cè)定。
[0004] 熒光報(bào)道探針只檢測(cè)特異性探針結(jié)合的DNA序列，因此顯著增加特異性。這允許 定量擴(kuò)增物，甚至在非特異性DNA擴(kuò)增存在的情況下。為了在相同反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)，熒 光探針可以用于多重測(cè)定中，其中具有不同顏色標(biāo)記的特異性探針用于每個(gè)目標(biāo)。熒光報(bào) 道探針的特異性還防止引物二聚體引起的測(cè)量干擾，所述引物二聚體是在擴(kuò)增過(guò)程中不期 望的副產(chǎn)物。大多數(shù)應(yīng)用基于熒光報(bào)道化合物和結(jié)合探針的熒光猝滅劑的相互作用。只要 報(bào)道分子和猝滅劑化合物密切靠近，則在用激發(fā)源（例如，激光，LED等）激發(fā)后只有基礎(chǔ) 熒光可以檢測(cè)到。一旦擴(kuò)增發(fā)生，則報(bào)道分子和猝滅劑化合物的相互作用受到破壞，導(dǎo)致可 檢測(cè)的熒光信號(hào)。在每個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物的增加導(dǎo)致熒光的成比例增加，這是由于報(bào) 道分子和猝滅劑化合物的相互作用減弱。通常，在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中檢測(cè)和測(cè)量熒光，并且其 對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物的指數(shù)增加的幾何增加用于測(cè)定每個(gè)反應(yīng)中的閾值循環(huán)（CT)。
[0005] 典型的動(dòng)態(tài)PCR曲線顯示于圖IA中，其中繪制了典型PCR過(guò)程的熒光強(qiáng)度值相對(duì) 于循環(huán)數(shù)。在這種情況下，在PCR過(guò)程的每個(gè)循環(huán)中監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的形成。擴(kuò)增通常在熱 循環(huán)儀中測(cè)量，其包括用于測(cè)量擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)的組分和設(shè)備。此類熱循環(huán)儀 的一個(gè)實(shí)例是Roche Diagnostics LightCycler (目錄號(hào)20110468)。擴(kuò)增產(chǎn)物，例如，借 助熒光標(biāo)記的雜交探針（所述探針只有當(dāng)結(jié)合目標(biāo)核酸時(shí)才發(fā)射熒光信號(hào)）來(lái)檢測(cè)，或者 在某些情況下還借助結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料來(lái)檢測(cè)。
[0006] 對(duì)于典型的PCR曲線，鑒定在基線區(qū)域末端的轉(zhuǎn)變點(diǎn)（其通常被稱為彎頭值或循 環(huán)閾值（Ct)值）對(duì)于理解PCR擴(kuò)增過(guò)程的特征極為有用。Ct值可用作PCR過(guò)程的效率的 量度。例如，通常對(duì)于待分析的所有反應(yīng)測(cè)定定義信號(hào)閾值，并且對(duì)于目標(biāo)核酸以及對(duì)于參 考核酸諸如標(biāo)準(zhǔn)或持家基因測(cè)定達(dá)到該閾值所需的循環(huán)數(shù)（Ct)。目標(biāo)分子（起始材料）的 絕對(duì)或相對(duì)拷貝數(shù)可以基于對(duì)于目標(biāo)核酸和參考核酸獲得的Ct值進(jìn)行測(cè)定（Gibson等人， Genome Research 6:995-1001; Bieche 等人，Cancer Research 59:2759-2765，1999; TO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714)。圖IA中在基線區(qū)域15末端的彎頭值20將 在循環(huán)數(shù)30的區(qū)域內(nèi)。
[0007] RNA或DNA的量可以通過(guò)將結(jié)果與已知量的RNA或DNA的連續(xù)稀釋物的實(shí)時(shí)PCR 產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增中目標(biāo)分子的絕對(duì)或相對(duì)拷 貝數(shù)可以通過(guò)將循環(huán)閾值（Ct)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線、與參考核酸的循環(huán)閾值（Ct)值或與絕對(duì)定 量的標(biāo)準(zhǔn)核酸進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。此外，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增的效率可以通過(guò)將待分 析的每個(gè)反應(yīng)的循環(huán)閾值（Ct)與參考核酸的循環(huán)閾值（Ct)進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定。
[0008] PCR曲線中的彎頭值可以使用幾種現(xiàn)有方法來(lái)測(cè)定。例如，各種方法將彎頭的實(shí)際 值（Ct)測(cè)定為其中歸一化的PCR曲線上的熒光達(dá)到預(yù)定信號(hào)水平的值，被稱為AFL(任意 熒光值），其可以對(duì)預(yù)彎頭（pre-elbow) PCR循環(huán)中平均基線熒光水平的變化敏感。其他方 法使用其中熒光的二階導(dǎo)數(shù)相對(duì)于循環(huán)數(shù)達(dá)到最大值的循環(huán)數(shù)，其可以給出晚期Ct值，特 別是對(duì)于拋物曲線。還有其他方法使用PCR曲線在拐點(diǎn)處的切線（最大一階導(dǎo)數(shù)），當(dāng)一階 導(dǎo)數(shù)的最大值不存在時(shí)，這對(duì)于拋物曲線是有問(wèn)題的。（Guescini, BMC Bioinformatics, 9:326，2008)。因此，后兩種方法都具有拋物曲線的缺點(diǎn)。美國(guó)專利8, 219, 366通過(guò)鑒定 此類曲線和使用用于此類問(wèn)題曲線的不同技術(shù)解決了拋物曲線的問(wèn)題。盡管該方法對(duì)于定 性實(shí)時(shí)PCR運(yùn)行良好，但當(dāng)應(yīng)用于定量實(shí)時(shí)PCR時(shí)，其在低拷貝數(shù)時(shí)可導(dǎo)致不精確的一些增 加。
[0009] 因此，期望提供用于測(cè)定生長(zhǎng)曲線（諸如實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線或其他生長(zhǎng)曲線）中 的Ct值的系統(tǒng)和方法，其克服了上述和其他問(wèn)題。
[0010] 概述 提供了用于根據(jù)可適用于各種實(shí)驗(yàn)條件的一種技術(shù)來(lái)測(cè)定Ct的系統(tǒng)、方法和裝置。 用于測(cè)定Ct的單一技術(shù)可用于標(biāo)準(zhǔn)S形生長(zhǎng)曲線和用于有問(wèn)題的生長(zhǎng)曲線，諸如拋物曲 線。Ct值可以確定為二階導(dǎo)數(shù)的最大值處相切于生長(zhǎng)曲線的線與生長(zhǎng)曲線的基線的交叉 點(diǎn)。此類Ct值可用于S形曲線和拋物曲線，并且可以提供線性校準(zhǔn)曲線以實(shí)現(xiàn)測(cè)定初始濃 度中的精確度。
[0011] 例如，實(shí)施方案可以測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)最大值處雙S形擬合（即，至PCR曲線的原始數(shù) 據(jù)點(diǎn)）的斜率和信號(hào)值。該斜率和信號(hào)值足以繪制與PCR曲線的基線相交的直線。該交叉 點(diǎn)然后可以定義為Ct值。
[0012] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，方法測(cè)定生長(zhǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)曲線中的循環(huán)閾值Ct。接收代表生 長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)具有一對(duì)坐標(biāo)值：循環(huán)數(shù)和在所 述循環(huán)數(shù)處的生長(zhǎng)過(guò)程的信號(hào)強(qiáng)度。計(jì)算近似數(shù)據(jù)集的函數(shù)。確定生長(zhǎng)曲線的基線，其中所 述基線是線性的。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算其中函數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)中的最大值出現(xiàn)的函數(shù)的第一點(diǎn)。 所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)確定在第一點(diǎn)相切于函數(shù)的切線。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算切線與基線的交叉點(diǎn)， 其中所述交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)是循環(huán)閾值ct。
[0013] 其他實(shí)施方案涉及與本文所述的方法相關(guān)的系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
[0014] 本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解可以參考以下詳述和附圖獲得。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述 圖IA說(shuō)明典型的PCR生長(zhǎng)曲線的實(shí)例，其繪制為熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)。
[0016] 圖IB是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的模擬實(shí)時(shí)PCR曲線。
[0017] 圖2A顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的PCR曲線110的一階導(dǎo)數(shù)230的圖200。
[0018] 圖2B顯示根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的PCR曲線110的二階導(dǎo)數(shù)260的圖250。
[0019] 圖3顯示圖300,其具有模擬實(shí)時(shí)PCR曲線110,其說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案測(cè) 定 Ct 375。
[0020] 圖4是說(shuō)明測(cè)定生長(zhǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)曲線中循環(huán)閾值Ct的方法400的流程圖。
[0021] 圖5A顯示由根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的PCR曲線110放大5倍的PCR曲線510的 圖500。圖5B顯示由根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方