案的PCR曲線110縮小1/5的PCR曲線510的圖 500 〇
[0022] 圖6A顯示PCR數(shù)據(jù)點605和近似根據(jù)本發(fā)明的實施方案的點605的函數(shù)610的 圖600。圖6B顯示函數(shù)610的二階導(dǎo)數(shù)660的圖650。
[0023] 圖7A顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案的確定的校準曲線710的圖700。圖7B顯示使 用二階導(dǎo)數(shù)最大值確定的校準曲線760的類似圖750。
[0024] 圖8A顯示使用二階導(dǎo)數(shù)最大值以及用于拋物曲線的拋物線方法測量的Ct和預(yù)期 Ct之間的相關(guān)線810的圖800。圖8B顯示使用本發(fā)明的實施方案測量的Ct和預(yù)期Ct之 間的相關(guān)線860的圖850。
[0025] 圖9顯示兩個原始數(shù)據(jù)曲線910和920的圖900。
[0026] 圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案的系統(tǒng)和方法可使用的示例性計算機系統(tǒng)1200 的方框圖。
[0027] 圖11是顯示可用于實施本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的軟件和硬件資源之間的關(guān)系的總 體方框圖的實例。
[0028] 圖12是顯示熱循環(huán)儀設(shè)備和計算機系統(tǒng)之間的關(guān)系的總體方框圖的實例。
[0029] 詳述 可以分析樣品的生長曲線（例如，實時聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)曲線）以測定初始濃度。 通常，循環(huán)閾值Ct (也稱為彎頭值）用作初始濃度的代表，其中校準曲線可用于從測量的Ct 測定相應(yīng)的初始濃度。然而，可難以測定一致的Ct值，因為某些生長（擴增）曲線可以是 有問題的?？梢允褂貌煌募夹g(shù)用于這些有問題的曲線，但這樣做可以損害校準曲線和正 確地定量初始濃度的能力。
[0030] 本發(fā)明的實施方案提供了用于測定Ct的單一技術(shù)，其可用于標準S形生長曲線和 用于有問題的生長曲線，諸如拋物曲線。Ct值可以確定為二階導(dǎo)數(shù)的最大值處相切于生長 曲線的線與生長曲線的基線的交叉點。此類Ct值可用于S形曲線和拋物曲線，并且可以提 供線性校準曲線以實現(xiàn)測定初始濃度中的精確度。首先提供實時PCR曲線的初步描述。
[0031] I.總體概覽 在動態(tài)PCR過程的背景下的擴增曲線10的一個實例顯示于圖IA中。如所示，曲線10 包括停滯期區(qū)域15和指數(shù)期區(qū)域25。停滯期區(qū)域15通常被稱為基線或基線區(qū)域。此類曲 線包括連接停滯期和指數(shù)期的轉(zhuǎn)變區(qū)域20。區(qū)域20通常被稱為彎頭（elbow)或彎頭區(qū)域 (elbow region)。彎頭區(qū)域通常定義末端至基線和基本過程的生長或擴增速率的轉(zhuǎn)變。鑒 定區(qū)域20中的特定轉(zhuǎn)變點可用于分析基本過程的行為。
[0032] 在典型的PCR曲線中，鑒定被稱為彎頭值或循環(huán)閾值（Ct)值的轉(zhuǎn)變點對于理解 PCR過程的效率特征極為有用。例如，Ct值可用于提供分析的樣品中存在的DNA量的定量。 定量通過進行Log(DNA量）相對于Ct值的校準曲線來獲得。然后隨后的樣品可以使用Ct 值連同校準曲線以直接獲得樣品中DNA的估計值。Ct值也可用于提供關(guān)于DNA樣品的定性 信息。
[0033] 可以提供類似的S形或生長曲線的其他過程包括細菌過程、酶促過程和結(jié)合過 程。在細菌生長曲線中，例如，目標轉(zhuǎn)變點已被稱作延遲期中的時間，λ。產(chǎn)生可根據(jù)本 發(fā)明分析的數(shù)據(jù)曲線的其他特定方法包括鏈置換擴增（SDA)方法、基于核酸序列的擴增 (NASBA)方法和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增（TMA)方法。SDA和NASBA方法和數(shù)據(jù)曲線的實例分別可 見 Wang, Sha-Sha,等人，''Homogeneous Real-Time Detection of Single-Nucleotide Polymorphisms by Strand Displacement Amplification on the BD ProbeTec ET System," Clin Chem 2003 49 (10) : 1599,和 Weusten，Jos J. A. M·，等人，"Principles of Quantitation of Viral Loads Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification in Combination With Homogeneous Detection Using Molecular Beacons, 〃 Nucleic Acids Research, 2002 30 (6): 26。因此，盡管本文的剩余部分將在其對于PCR曲線的適用 性方面討論本發(fā)明的實施方案和方面，但是應(yīng)當理解的是，本發(fā)明可以應(yīng)用于與其他方法 相關(guān)的數(shù)據(jù)曲線。
[0034] 如圖IA中所示，對于典型的PCR生長曲線的數(shù)據(jù)可以在二維坐標系中代表，例如， 其中PCR循環(huán)數(shù)定義X軸，且累積的多核苷酸生長的指標定義y軸。通常，累積生長的指標 是熒光強度值，因為熒光標記的使用可能是最廣泛使用的標記方案。然而，應(yīng)當理解的是， 其他指標可以根據(jù)使用的具體標記和/或檢測方案來使用。累積信號生長的其他有用指 標的實例包括發(fā)光強度、化學(xué)發(fā)光強度、生物發(fā)光強度、磷光強度、電荷轉(zhuǎn)移、電壓、電流、功 率、能量、溫度、粘度、光散射、放射性強度、反射率、透射率和吸光度。所有此類實例落在信 號強度下。循環(huán)的定義也可以包括時間、過程循環(huán)、單元操作循環(huán)和再生循環(huán)。
[0035] IL 測定 Ct 值 實施方案使用二階導(dǎo)數(shù)的最大值處相切于生長曲線的線與生長曲線的基線的交叉點。 為了獲得生長曲線的二階導(dǎo)數(shù)的最大值的點，可以獲得特定生長過程（例如，實時PCR)的 數(shù)據(jù)點的函數(shù)近似（曲線擬合）?？梢杂嬎愫头治龊瘮?shù)的二階導(dǎo)數(shù)以確定在最大值在哪個 循環(huán)（xval)出現(xiàn)。切線然后可以基于該函數(shù)在xval的斜率來確定。在確定函數(shù)的基線后， 可以計算切線與基線的交叉點。Ct值然后返回，并且可以顯示或另外用于進一步處理。此 類Ct值可用于S形曲線和拋物曲線，并且可以提供線性校準曲線以實現(xiàn)測定初始濃度中的 精確度。模擬的生長曲線現(xiàn)在用于說明實施方案。
[0036] 圖IB顯示圖100,其具有根據(jù)本發(fā)明的實施方案的模擬實時PCR曲線110。PCR 曲線110具有水平（X)軸上的循環(huán)數(shù)和垂直（y)軸上的強度（例如，熒光）。PCR曲線110 具有良好定義的基線115。如所示，基線115是在等于2的強度（y)的水平線。為了便于 代表，不存在模擬基線115的斜率。然而，基線可以具有任何具有斜率的線性形式。彎頭區(qū) 域120位于基線115和指數(shù)期區(qū)域125之間。指數(shù)期區(qū)域125包括拐點128,其中PCR曲線 110開始向下彎曲，與彎頭區(qū)域120中的向上相反。
[0037] 盡管模擬PCR生長曲線110,但PCR生長曲線可以從每個循環(huán)采集的強度數(shù)據(jù)點來 確定?？梢约僭O(shè)具體函數(shù)形式，并且可以確定參數(shù)，使得具體函數(shù)形式近似于數(shù)據(jù)點。在一 些實施方案中，具有通過Levenberg-Marquardt (LM)回歸方法確定的參數(shù)的雙S形函數(shù)可 以用來發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)點的近似值。在其他實施方案中，可以使用其他函數(shù)形式，例如，如有限元 分析、單一S形函數(shù)或在目標區(qū)域具有連續(xù)二階導(dǎo)數(shù)的一種或多種函數(shù)的任何集合中可存 在的使用具有連續(xù)邊界條件（例如，連續(xù)至二階導(dǎo)數(shù)）的多項式的內(nèi)插。在一個方面，曲線 近似和參數(shù)可用于預(yù)先處理數(shù)據(jù)信號，例如，以歸一化數(shù)據(jù)信號和/或去除可以存在于數(shù) 據(jù)信號中的峰值（spikes)或異常數(shù)據(jù)點。
[0038] 圖2A顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案的PCR曲線110的一階導(dǎo)數(shù)230的圖200。X軸 仍然是循環(huán)數(shù)，但y軸是每個循環(huán)的強度變化單位，因為圖200顯示一階導(dǎo)數(shù)。一階導(dǎo)數(shù) 230可以通過取由對數(shù)據(jù)點的曲線擬合過程導(dǎo)致產(chǎn)生的函數(shù)的一階導(dǎo)數(shù)來確定。如所示，一 階導(dǎo)數(shù)230在拐點228 (其對應(yīng)于拐點128)具有最大值。
[0039] 圖2B顯示根據(jù)本發(fā)明的實施方案的PCR曲線110的二階導(dǎo)數(shù)260的圖250。二階 導(dǎo)數(shù)260可以通過取由對數(shù)據(jù)點的曲線擬合過程導(dǎo)致產(chǎn)生的函數(shù)的二階導(dǎo)數(shù)來確定。拐點 顯示為點278,其對應(yīng)于二階導(dǎo)數(shù)260是零的點。二階導(dǎo)數(shù)260在點265具有最大值，其出 現(xiàn)在循環(huán)xval。在圖2B中，xval等于32. 36。最大值可以各種方式發(fā)現(xiàn)，例如，通過沿著 二階導(dǎo)數(shù)260的值搜索或通過確定三階導(dǎo)數(shù)的零值。如所看到，二階導(dǎo)數(shù)最大值265在拐 點278之前出現(xiàn)。
[0040] -旦確定xval，則可以確定在循環(huán)xval的PCR曲線的斜率。在一個實施方案中， 斜率可以通過取在循環(huán)xval的一階導(dǎo)