利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程與生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化 生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶飲料作為一種全球流行的植物飲料，其在抗癌和心血管等疾病的保健功效 已經(jīng)得到公認(rèn)。目前認(rèn)為，兒茶素是茶葉中的主要功能活性成分，含量占茶多酚總量的 60~80%，包括表兒茶素（EC)、表兒茶素沒食子酸酯（ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (EGCG)、表沒食子兒茶素（EGC)、沒食子酸（GA)、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG)。茶葉中 EGCG含量最高，占到茶葉干重的9~13%。茶多酚具有許多重要的保健功效，有很強(qiáng)的抗 氧化活性和清除自由基的能力、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗癌作用、抗菌抗病毒活性和抑制脂 肪積累的減肥功效等。
[0003] 普洱茶作為一種后發(fā)酵茶，通過微生物發(fā)酵，茶葉兒茶素成分通過生物轉(zhuǎn)化，形成 獨(dú)特的品質(zhì)特性和功能特性。在普洱茶發(fā)酵過程中，兒茶素含量下降，EGCG和ECG等酯型 兒茶素被完全降解，但普洱茶仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗癌、抗菌和降血脂降膽固醇等保健功效， 說明普洱茶品質(zhì)形成過程中，兒茶素被微生物分解轉(zhuǎn)化形成了新的功能性成分。事實(shí)上，喝 茶后，茶多酚在消化道上段不能被分解利用，同時(shí)也很少被吸收。絕大多數(shù)茶多酚（超過 90% )進(jìn)入到結(jié)腸，被結(jié)腸微生物所分解后再被結(jié)腸吸收，然后進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)起作用，一部 分則被排出體外。因此，茶多酚的低生物可利用度與其功能特性形成悖論。如何提高茶多 酚的生物可利用度近年來已成為業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)。Macedo，JA et al研宄發(fā)現(xiàn)，采用丹寧酶 轉(zhuǎn)化茶多酚和EGCG后其抗氧化活性和抗癌活性均有明顯的增強(qiáng)。茶多酚體外轉(zhuǎn)化將在結(jié) 腸中微生物的消化分解轉(zhuǎn)移到體外進(jìn)行，相當(dāng)于延長(zhǎng)的動(dòng)物消化道，可大大提高茶多酚的 生物可利用度。
[0004] 茶多酚體外轉(zhuǎn)化可選擇酶轉(zhuǎn)化的方式。東華大學(xué)采用米曲霉ATCC 20719菌株和 黑曲霉ATCC 46890菌株制備表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯（EGCG)水解酶對(duì)EGCG進(jìn)行 降解獲得表沒食子酸兒茶素（EGC)和沒食子酸（GA)，兩種菌株制備酶液發(fā)酵過程均需要 48-120h，米曲霉獲得的酶液需在40°C的反應(yīng)體系中，處理24h完成轉(zhuǎn)化，而黑曲霉獲得的 酶液需要在25-60°C，反應(yīng)0_48h或直至水解反應(yīng)結(jié)束方可停止。酶轉(zhuǎn)化成本較高，需購買 酶制劑或自己制備酶液，工藝復(fù)雜。為降低成本，可直接采用微生物全細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化， 從發(fā)表的文獻(xiàn)來看，采用黑曲霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化EGCG酶轉(zhuǎn)化效率最高為發(fā)酵時(shí)間為5d。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種利用黑曲霉全細(xì) 胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子 兒茶素和沒食子酸的方法，采用黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株進(jìn)行全細(xì)胞生物 轉(zhuǎn)化，全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)液為含有茶多酚或EGCG質(zhì)量百分含量1~20%的營(yíng)養(yǎng)液。
[0007] 所述的黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日， 保藏編號(hào)為CGMCC NO.9608,保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC);保藏單位地址為中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)（100101)。
[0008] 所述的黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株具有以下生物學(xué)特性：菌落表面 平坦，邊緣整齊，培養(yǎng)基背面呈乳白色，中間稍有乳黃色，基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)。在25°C的察氏平板 培養(yǎng)基上培養(yǎng)8d，RAF106菌落直徑為51. 0±1. 53mm，邊緣有少量白色絨毛狀氣生菌絲，菌 落表面呈灰褐色，表面有小滴狀黑色滲透液（見圖2)。菌落形態(tài)不規(guī)則，表面褶皺狀，培養(yǎng) 基背面呈黑褐色。
[0009] 黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全長(zhǎng)堿基序列如SEQIDNO:1所示。
[0010] 所述的黑曲霉RAF106菌株應(yīng)用種子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，獲得黑曲霉RAF106菌 株的種子分生孢子；
[0011] 所述的種子培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH 自然，121°C滅菌20min。黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基也可使用市售的馬鈴薯蔗糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基。
[0012] 所述的種子培養(yǎng)的條件為：前子瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28~35°C，培養(yǎng)時(shí)間3~ 5d〇
[0013] 在所述的種子培養(yǎng)過程中，黑曲霉RAF106菌株的種子菌接種量為每毫升全細(xì)胞 生物轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)液接種1〇 2~10 8個(gè)黑曲霉RAF106菌株分生孢子。
[0014] 所述的黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子的獲取方法為：采用無菌生理鹽水沖 洗長(zhǎng)滿黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接種環(huán)輕輕刮取種子培養(yǎng)基表面，得到黑曲霉 分生孢子懸浮液。
[0015] 所述的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化為液態(tài)轉(zhuǎn)化。
[0016] 所述的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)液的配方為含有如下組分質(zhì)量百分含量的水溶液： 茶多酚或EGCG 1~20 %，磷酸氫二鉀0. 03~0. 8 %，磷酸二氫鉀0. 1~3 %，硫酸錳0. 03~ 〇? 7 %，氯化鈉0? 3~2 %，硫酸鎂0? 01~0? 3 %，酵母或麥芽提取物0? 02~2 % ; 121°C滅 菌 30min。
[0017] 所述的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的條件為：溫度25~42°C，搖床轉(zhuǎn)速160~220r/min，時(shí) 間20~60h。
[0018] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0019] (1)本發(fā)明所篩選到的黑曲霉菌株，對(duì)茶多酚的耐受性極高，采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化茶多 酚，其優(yōu)勢(shì)在于轉(zhuǎn)化方式簡(jiǎn)單、快速，可實(shí)現(xiàn)茶多酚高效轉(zhuǎn)化，大大提高轉(zhuǎn)化率和降低轉(zhuǎn)化 成本，且轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物抗癌活性明顯增強(qiáng)。
[0020] (2)本發(fā)明采用全細(xì)胞一步生物轉(zhuǎn)化EGCG，簡(jiǎn)便高效，茶多酚轉(zhuǎn)化效率高，20h即 可完全轉(zhuǎn)化￡606成為￡6(：和6纟，發(fā)酵2811其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗癌活性達(dá)到最強(qiáng)?！?06可100%得 到轉(zhuǎn)化，成本大大降低。茶多酚通過體外生物轉(zhuǎn)化，其生物活性明顯提高，可有效的殺死結(jié) 腸癌細(xì)胞。
【附圖說明】
[0021] 圖1是實(shí)施例中黑曲霉產(chǎn)生酯酶對(duì)兒茶素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的示意圖；
[0022] 圖2是實(shí)施例中黑曲霉RAF106菌株菌落的形態(tài)圖，其中：A為PDA平板中黑曲霉 RAF106菌株菌落的形態(tài)圖，B為察氏平板中黑曲霉RAF106菌株菌落的形態(tài)圖；
[0023] 圖3是實(shí)施例中經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化茶多酚20h時(shí)的HPLC圖譜，其中 左圖為未轉(zhuǎn)化的茶多酚的HPLC圖譜，右圖為經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化茶多酚20h時(shí) HPLC圖譜；
[0024] 圖4是實(shí)施例中經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化茶多酚28h時(shí)的HPLC圖譜，其中 左圖為未轉(zhuǎn)化的茶多酚的HPLC圖譜，右圖為經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化茶多酚28h時(shí) HPLC圖譜；
[0025] 圖5是實(shí)施例中經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化EGCG36h時(shí)的HPLC圖譜，其中左 圖為未轉(zhuǎn)化的EGCG的HPLC圖譜，右圖為經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化EGCG36h時(shí)HPLC 圖譜；
[0026] 圖6是實(shí)施例中經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化EGCG 48h時(shí)的HPLC圖譜，其中左 圖為未轉(zhuǎn)化的EGCG的HPLC圖譜，右圖為經(jīng)黑曲霉RAF106菌株生物轉(zhuǎn)化EGCG48h時(shí)HPLC 圖譜；
[0027] 圖7為茶多酚及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)HT-29的細(xì)胞毒性結(jié)果圖；
[0028] 圖8為茶多酚及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對(duì)HCT-116的細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保 藏編號(hào)為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC);保藏單位地址為中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)（100101)。
[0032] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸 餾水1000mL，pH自然，121°C滅菌15min。也可使用市售的馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基。
[0033] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)條件為：前子瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時(shí) 間4d。
[0034] 黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子的獲取方法為：采用無菌生理鹽水沖洗長(zhǎng)滿 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面，獲得黑曲霉分生孢子懸 浮液，并采用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至孢子濃度為1 x 108個(gè)/mL。
[0035] 全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)液配方為：茶多酚2%，磷酸氫二鉀0.03%，磷酸二氫鉀 0. 5 %，氯化鈉0. 8 %，硫酸錳0. 7 %，硫酸鎂0. 2 %，麥芽提取物0. 05 %，121°C滅菌30min，所 述的百分比為質(zhì)量百分比。
[0036]全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的條件：溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，時(shí)間20h。
[0037] 取色譜級(jí)甲醇與三蒸水（1 :1)將轉(zhuǎn)化后的混合液稀釋100倍后，采用0. 02 ym濾 膜過濾，將濾液適度稀釋后直接進(jìn)行HPLC檢測(cè)產(chǎn)物濃度，結(jié)果如圖3所示；從圖3可以看 出，轉(zhuǎn)化20h時(shí)，EGCG幾乎被全部轉(zhuǎn)化。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] 黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保 藏編號(hào)為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC);保藏單位地址為中國(guó)北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)（100101)。
[0040] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基的配方為