：市售的馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA)培養(yǎng) 基。
[0041] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)條件為：前子瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)時 間3d。
[0042] 黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子的獲取方法為：采用無菌生理鹽水沖洗長滿 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面，獲得黑曲霉分生孢子懸 浮液，并采用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至孢子濃度為1 x 108個/mL。
[0043] 全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液配方為：茶多酚1. 2%，磷酸氫二鉀0. 4%，磷酸二氫鉀 0. 3%，氯化鈉0. 3%，硫酸錳0. 7%，硫酸鎂0. 03%，酵母提取物1. 2%，121°C滅菌30min，所 述的百分比為質(zhì)量百分比。
[0044]全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的條件：溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，時間28h。
[0045] 取色譜級甲醇與三蒸水（1 :1)將轉(zhuǎn)化后的混合液稀釋100倍后，采用0. 02 ym濾 膜過濾，將濾液適度稀釋后直接進(jìn)行HPLC檢測產(chǎn)物濃度，結(jié)果如圖4所示；從圖4可以看 出，轉(zhuǎn)化28h時，EGCG已經(jīng)被全部轉(zhuǎn)化，EGCG生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的GA也被部分分解。
[0046] 實(shí)施例3
[0047] 黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保 藏編號為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC);保藏單位地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（100101)。
[0048] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾 水1000mL，pH自然，121°C滅菌15min。黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)條件為：茄子瓶靜置 培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時間2d。
[0049] 黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子的獲取方法為：采用無菌生理鹽水沖洗長滿 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面，獲得黑曲霉分生孢子懸 浮液，并采用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至孢子濃度為1 x 108個/mL。
[0050] 全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液配方為：EGCG 5%，磷酸氫二鉀0. 8%，磷酸二氫鉀1%， 氯化鈉0. 6 %，硫酸錳0. 5 %，硫酸鎂0. 03 %，酵母提取物2 %，121°C滅菌30min，所述的百分 比為質(zhì)量百分比。
[0051] 全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的條件：溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，時間36h。
[0052] 取色譜級甲醇與三蒸水（1:1)將轉(zhuǎn)化后混合液稀釋100倍后，采用0.02ym濾膜 過濾，將濾液適度稀釋后直接進(jìn)行HPLC檢測產(chǎn)物濃度，結(jié)果如圖5所示；從圖5可以看出， 轉(zhuǎn)化36h時，EGCG幾乎被全部轉(zhuǎn)化。
[0053] 實(shí)施例4
[0054] 黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8月27日，保 藏編號為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC);保藏單位地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（100101)。
[0055] 黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾 水1000mL，pH自然，121°C滅菌15min。黑曲霉RAF106菌株的種子培養(yǎng)條件為：茄子瓶靜置 培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 °C，培養(yǎng)時間5d。
[0056] 黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子的獲取方法為：采用無菌生理鹽水沖洗長滿 黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接種環(huán)輕輕刮取培養(yǎng)基表面，獲得黑曲霉分生孢子懸 浮液，并采用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至孢子濃度為1 x 108個/mL。
[0057] 全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液配方為：EGCG 15%，磷酸氫二鉀0.2%，磷酸二氫鉀 0. 1 %，氯化鈉1. 6 %，硫酸錳0. 06 %，硫酸鎂0. 3 %，麥芽提取物1. 6 %，121°C滅菌30min，所 述的百分比為質(zhì)量百分比。
[0058]全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的條件：溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，時間48h。
[0059] 取色譜級甲醇與三蒸水（1:1)將轉(zhuǎn)化后混合液稀釋100倍后，采用0.02ym濾膜 過濾，將濾液適度稀釋后直接進(jìn)行HPLC檢測產(chǎn)物濃度，結(jié)果如圖6所示；從圖6可以看出， 轉(zhuǎn)化48h時，EGCG已經(jīng)被全部轉(zhuǎn)化，EGCG生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的GA也被部分分解。
[0060] 實(shí)施例5
[0061] 采用RPMI1640培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)HT-29細(xì)胞和HCT-116細(xì)胞，傳代培養(yǎng)4d收集細(xì) 胞計數(shù)，按照濃度350cell/ml種植于6孔板，37°C，培養(yǎng)24h ;
[0062] 吸去培養(yǎng)基，將樣品TO(轉(zhuǎn)化Oh樣品），T28 (轉(zhuǎn)化28h樣品）分別用DMSO稀釋至 2. 5mg/ml，5mg/ml和10mg/ml三個濃度，取5ml RPMI于MTT管，每管分別加入樣品5ul，振 蕩均勻后，按每空2ml樣品液處理；并于第4、8d更換HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)基和樣品。HCT-116 細(xì)胞培養(yǎng)皿則在第4d直接在倒置顯微鏡拍照記錄。
[0063] 染色：第10d吸去培養(yǎng)基，每孔取0.6ml結(jié)晶紫（0.2%，溶解于2%乙醇），染色 lOmin，然后用蒸餾水清洗4次，置通風(fēng)櫥風(fēng)干。
[0064] 掃描：將6孔板置掃描儀掃描獲得圖片。
[0065] 結(jié)果分析：圖7為茶多酚及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對HT-29的細(xì)胞毒性，可見，采用T0和 T28處理后，HT-29細(xì)胞群落數(shù)量明顯減少，T28細(xì)胞群落數(shù)量最少，說明茶多酚生物轉(zhuǎn)化 后，對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。圖8為茶多酚及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對HCT-116 的細(xì)胞凋亡的影響，茶多酚生物轉(zhuǎn)化后，能顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的細(xì)胞凋亡。
[0066] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法，其特征在于， 采用黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株進(jìn)行全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化，全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營 養(yǎng)液為含有茶多酚或EGCG質(zhì)量百分含量1~20%的營養(yǎng)液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，所述的黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期為2014年8 月27日，保藏編號為CGMCC NO. 9608,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（CGMCC);保藏單位地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，所述的黑曲霉（Aspergillus niger)RAF106菌株應(yīng)用種子培養(yǎng)基進(jìn)行種 子培養(yǎng)，獲得黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子； 所述的種子培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，pH自然， 121°C 滅菌 20min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)的條件為：茄子瓶靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C~35°C，培 養(yǎng)時間3~5d。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，在所述的種子培養(yǎng)過程中，黑曲霉RAF106菌株的種子菌接種量為每暈 升全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液接種1〇 2~10 8個黑曲霉RAF106菌株分生孢子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106菌株的種子分生孢子的獲取方法為：采用無菌生 理鹽水沖洗長滿黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接種環(huán)輕輕刮取種子培養(yǎng)基表面，得 到黑曲霉分生孢子懸浮液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，所述的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化為液態(tài)轉(zhuǎn)化。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的 方法，其特征在于，所述的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液的配方為含有如下組分質(zhì)量百分含量 的水溶液：茶多酚或EGCG 1~20 %，磷酸氫二鉀0. 03~0. 8 %，磷酸二氫鉀0. 1~3 %，硫 酸錳0. 03~0. 7 %，氯化鈉0. 3~2 %，硫酸鎂0. 01~0. 3 %，酵母或麥芽提取物0. 02~ 2% ;121°C滅菌 30min。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸 的方法，其特征在于，所述的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的條件為：溫度25~42°C，搖床轉(zhuǎn)速160~ 220r/min，時間 20 ~60h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用黑曲霉全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)表沒食子兒茶素和沒食子酸的方法。該方法采用黑曲霉(Aspergillus niger)進(jìn)行全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化，全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液為含茶多酚或EGCG 1～20％的營養(yǎng)液；黑曲霉RAF106菌株的保藏編號為CGMCC NO.9608。全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)液的配方為：茶多酚或EGCG1～20％，磷酸氫二鉀0.03～0.8％，磷酸二氫鉀0.1～3％，硫酸錳0.03～0.7％，氯化鈉0.3～2％，硫酸鎂0.01～0.3％，酵母或麥芽提取物0.02～2％。采用該營養(yǎng)液進(jìn)行全細(xì)胞一步轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率高，20h可完成轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺滅活性高。CGMCC No.960820140827
【IPC分類】C12P17-06, C12P7-42, C12R1-685
【公開號】CN104673845
【申請?zhí)枴緾N201510085412
【發(fā)明人】方祥, 章愛媛, 劉文瑤
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月15日