一種橡膠樹白粉病菌rna的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種橡膠樹白粉病菌RNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 橡膠樹白粉病是由粉孢屬的橡膠粉孢（腫AereaeB.A.Steinmann)侵染引起 的病害，該病菌廣泛分布于全球各橡膠種植區(qū)，也是我國植膠區(qū)早春防治"兩病一蟲"的重 點。橡膠樹白粉菌是專性寄生菌，無法在人工培養(yǎng)基離體培養(yǎng)，難遺傳操作，更多研宄集中 于細(xì)胞學(xué)觀察和防治，目前尚未培育出生產(chǎn)上大規(guī)模推廣的抗白粉菌橡膠樹品系，關(guān)于橡 膠樹白粉菌致病基因功能驗證的分子實驗體系尚未建立，病原菌致病機理缺乏詳盡研宄。 萬三連等通過改良Trizol提取方法獲取的白粉菌RNA能夠滿足構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫要求。改 良Trizol提取RNA法，是在Trizol真菌RNA提取法基礎(chǔ)上提高提取液的鹽濃度，增加溶液 中的鹽濃度可以減少RNA溶于提取液中，促進多糖及蛋白等溶于溶液。同時，結(jié)合OMEGA真 菌RNA試劑盒法中的制備管吸附RNA，可以減少揮發(fā)乙醇的時間，防止RNA降解。
[0003] 改進的Trizol方法收集提取的白粉菌實際上是孢子和菌絲組織混合體RNA，無法 獲得白粉菌在萌發(fā)及附著胞形成狀態(tài)均一的孢子，缺少侵染發(fā)育過程中白粉菌組織的培養(yǎng) 收集和RNA提取手段，無法開展侵染過程中功能基因的表達研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本本發(fā)明提出一種橡膠樹白粉病菌RNA的提取方法，所得的RNA濃度及完整性符 合Illumina轉(zhuǎn)錄組文庫要求。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的： 一種橡膠樹白粉病菌的RNA的提取方法，包括以下步驟： (1) 采用接菌培養(yǎng)l〇~12d后24h齡的新鮮分生孢子作為實驗菌源；將疏水介質(zhì)置于 底部有濕潤濾紙的保鮮盒中，用軟毛刷將橡膠葉片上的白粉菌孢子輕刷于疏水介質(zhì)表面， 培養(yǎng)溫度21~23°C，相對濕度50%~80%，保鮮盒避光密封保存； (2) 保鮮盒中培養(yǎng)0~24h后，加入預(yù)冷的Trizol裂解液于介質(zhì)上，用涂抹棒蘸取裂解 液反復(fù)涂刮接菌介質(zhì)表面，待介質(zhì)上的裂解液內(nèi)可見白色粉狀物或出現(xiàn)渾濁時，用移液器 收集裂解液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中，震蕩混勻，20~25°C靜置8~10min; (3) 離心管加入氯仿，振蕩混勻，20~25°C靜置后離心； (4) 離心后，轉(zhuǎn)移上層水相到新的RNasefree離心管中，加入醋酸鉀，顛倒混勻，離心， 20~25°C靜置得混合溶液； (5) 加入與混合液等體積的異丙醇，混勻，沉降RNA樣品； (6) 經(jīng)步驟（5)處理后，離心后移去上清液，加入DEPC水溶解沉淀；隨后加入RB、70%乙 醇和巰基乙醇，顛倒混勻； (7) 經(jīng)步驟（6)處理后，離心后加入DEPC水洗脫RNA，即得橡膠樹白粉病菌RNA。
[0006] 進一步，所述步驟（1)接種前24h搖動葉片抖落老孢子，以新生24h齡分生孢子 作為接種材料；所述的疏水介質(zhì)為Parafilm膜。
[0007] 進一步，所述步驟（2)震蕩后確保離心管中無真菌團塊。
[0008] 進一步，所述步驟（3)加入氯仿體積為離心管內(nèi)液體體積的1/4~1/3;振蕩時間為 15~20s，0~25°C靜置時間為5~7min，離心的條件為4°C，10000~12000g，離心15~20min; 2〇
[0009] 進一步，所述步驟（4)加入醋酸鉀溶液的體積為水相體積的1/3,pH值為6. 0 ;離 心條件為4°C，8000~10000g，離心1. 0~L5min;靜置時間為5~7min。
[0010] 進一步，所述步驟（5)RNA樣品沉降時間為2~10h，沉降過程中控制溫度-80 °C。
[0011] 進一步，所述步驟（6)離心操作條件為4 °C，12000~14000g，離心10 ~12min;加 入的DEPC水、RB、70%乙醇和0 -巰基乙醇的體積比=100~120 :350~400 :250~300 :7~9。
[0012] 進一步，所述步驟（7)離心操作條件為4 °C，10000~12000g，離心時間30~40s; DEPC水的加入量為步驟（6)所得樣品總體積的1/7~1/6。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 接種前，通過培養(yǎng)i2d后，新鮮a子形態(tài)飽滿，活力旺盛，選取同一批次Aereae新鮮分生孢子接種Parafilm膜，保證子在介質(zhì)上侵染發(fā)育狀態(tài)的一 致性。在parafilm疏水介質(zhì)上培養(yǎng)后，觀察白粉菌侵染無需染色脫色等步驟，保存了病原 菌原始形態(tài)，便于區(qū)分白粉菌發(fā)育的不同階段，從而達到分階段提取RNA的目的。觀察發(fā)現(xiàn) ttAereae0~24hpi侵染發(fā)育過程可分為未萌發(fā)（0hpi)、萌發(fā)（4hpi)、附著胞形成（6,8 hpi)和次生附著胞形成（16, 24hpi)等4個形態(tài)顯著的發(fā)育階段，提取相應(yīng)階段總RNA即 獲得該狀態(tài)下AAereae轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)定量測定顯示RNA濃度及完整性符合Illumina轉(zhuǎn)錄組 文庫要求，采用RT-PCR擴增18SrRNA基因，為進一步開展轉(zhuǎn)錄組測序分析和基因表達研宄 提供基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0014] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0015]圖1為橡膠樹白粉菌不同發(fā)育時段的形態(tài)特征示意圖； 圖中，A:0hpi分生孢子（200X);B:4hpi孢子萌發(fā)（200X);C:6hpi附著胞形成 (200X);D:8hpi附著胞形成（400X);E:16hpi次生附著胞形成（400X);F:24hpi次生 附著胞形成（200X)。CO:分生孢子；gt:芽管；AP:附著胞 圖2為不同時段提取得到的RNA樣品電泳； 圖3為18S基因在不同時段的表達電泳。
【具體實施方式】
[0016] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0017] 實施例1 (1) 選取橡膠7-33-97品系嫁接苗7-10天葉齡葉片作為培養(yǎng)Aewae材料，采用接菌 培養(yǎng)12d后HO-73 24h齡新鮮分生孢子作為實驗菌源。接種前24h輕搖葉片抖落老孢子， 以新生24h齡分生孢子作為接種材料，確保實驗中孢子活力及侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育均一性；將 Parafilm(美國BEMIS產(chǎn)品）膜置于底部有濕潤濾紙的保鮮盒（40cmX30cm)中，用軟毛 刷將橡膠葉片上的白粉菌孢子輕刷于Parafilm膜表面，培養(yǎng)溫度22°C，相對濕度50%~80%， 保鮮盒避光密封保存； (2) 轉(zhuǎn)移至Parafilm膜表面培養(yǎng)后，立即加2mL預(yù)冷的Trizol(美國Invitrogen公 司)裂解液于Parafilm膜上，用涂抹棒蘸取裂解液反復(fù)涂刮接菌介質(zhì)表面，待介質(zhì)上的裂解 液內(nèi)可見白色粉狀物或出現(xiàn)渾濁時，用移液器收集裂解液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的2. 0mL離心管中， 每管分裝1mL，震蕩混勻30s，并確保離心管中無真菌團塊，20~25°C靜置10min; (3) 每離心管加入250yL氯仿，劇烈振蕩15s，20~25°C靜置，5min后，在4 °C，12000g，離心 15min; (4) 離心后，轉(zhuǎn)移上層水相到新的RNasefree2mL離心管中；加入1/3溶液體積的醋 酸鉀（pH=6. 0)，顛倒混勻并4 °C，8000g，離心1min，20~25°C靜置5min，得混合溶液； (5) 混合溶液加入等體積的異丙醇，充分混勻，置于-80 °C沉降RNA樣品2h; (6) 經(jīng)步驟（5)處理后，在4 °C，14000g，離心10min;(7)經(jīng)步驟（6)處理后，小心移 去上清，加入100yLDEPC水溶解沉淀；隨后參照Omega真菌RNA試劑盒(美國Omega公司） 提取方法洗脫步驟進行，加入350yLRB，250yL70%乙醇，7yL 巰基乙醇，顛倒混 勻。
[0018] (7)將總體積 700yL樣品轉(zhuǎn)移至RNAminicolumn管中，4 °C，10000g，30s離 心；最終100yLDEPC水洗脫RNA，即得橡膠樹白粉病菌RNA;所得的RNA-80°C保存。
[0019] 實施例2 (1) 選取橡膠7-33-97品系嫁接苗7-10天葉齡葉片作為培養(yǎng)Aewae材料，采用接菌 培養(yǎng)10d后HO-73 24h齡新鮮分生孢子作為實驗菌源。接種前24h輕搖葉片抖落老孢子， 以新生24h齡分生孢子作為接種材料，確保實驗中孢子活力及侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育均一性；將 Parafilm(