一種抗癌藥物的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用原位鄰位連接技術(shù)篩選能夠破 壞Hsp90和Cdc37相互作用的抗癌藥物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鄰位連接技術(shù)（proximity ligation assay, PLA)是一項(xiàng)高度特異和靈敏的蛋白 質(zhì)分析技術(shù)。能夠檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平、蛋白質(zhì)之間的相互作用和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾(如 磷酸化修飾)，已經(jīng)被應(yīng)用于一系列的生物研宄系統(tǒng)中。該方法通過兩個分別特異性針對目 標(biāo)蛋白的抗體識別復(fù)合物中的兩個相互作用的蛋白。這種方法通過在種屬性抗體上修飾單 鏈DNA寡核苷酸，形成鄰位探針，識別針對目的蛋白的特異性抗體。如果這兩個特異性抗體 結(jié)合的抗原相互作用，可以使兩對相對應(yīng)的種屬性抗體連接的DNA也在空間上靠近，可以 和隨后加入的兩條連接DNA共同形成一個DNA環(huán)，作為滾環(huán)復(fù)制（RCA)的模板，并通過滾環(huán) 復(fù)制形成大量的連續(xù)單鏈DNA。這時，加入一個修飾有熒光標(biāo)記的DNA短序列，它能夠雜交 到環(huán)上，大量的單熒光信號堆積，在顯微鏡下可以觀察到一個個點(diǎn)，這就是能夠直接觀測到 相互作用的兩個蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞中的定位。而傳統(tǒng)的免疫熒光只能夠?qū)蓚€蛋白質(zhì)共定 位。原位PLA技術(shù)檢測操作簡單，并且可以建立劑量響應(yīng)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算蛋白間親和能 力(半數(shù)最高抑制濃度，IC50 )。PLA技術(shù)作為一項(xiàng)新的蛋白質(zhì)分析工具，可以檢測蛋白水平、 蛋白間的相互作用、蛋白的翻譯后修飾水平的變化，具有很高的特異性和靈敏度，可以用于 炎癥、腫瘤疾病等病理生理過程研宄，甚至可用于細(xì)胞表面蛋白功能狀態(tài)的觀察，以及病毒 和細(xì)菌等感染因子的檢測，在基礎(chǔ)研宄和疾病診斷等研宄領(lǐng)域中具有重大意義。
[0003] 熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs)也稱作應(yīng)激蛋白，是一系列高度保守且 功能強(qiáng)大的分子伴侶，其中Hsp90占細(xì)胞總蛋白量的1%-2%，主要包括3個結(jié)構(gòu)域，（1)N端 結(jié)構(gòu)域，約25kDa，包括與蛋白ATP酶活性相關(guān)的腺嘌呤結(jié)合區(qū)；（2)中間結(jié)構(gòu)域，約35kDa， 能夠與其他分子伴侶以及其他蛋白發(fā)生結(jié)合的區(qū)域；（3)C端結(jié)構(gòu)域，約10kDa，含有MEEVE 序列，能夠和一些含TPR結(jié)構(gòu)域的共分子伴侶結(jié)合，也可形成自身的二聚化。蛋白質(zhì)HSP90 在大量的細(xì)胞過程、進(jìn)化和疾病中都扮演著重要的角色。正常情況下，它能夠防止蛋白錯誤 折疊發(fā)生聚集，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞在壓力/非壓力狀態(tài)下的生命活力，能夠與凋亡效應(yīng)因子相 互作用抗凋亡。Hsp90的底物蛋白多是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白成分，與腫瘤的發(fā) 生、發(fā)展密切相關(guān)，這些蛋白質(zhì)的過表達(dá)或過度激活是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的標(biāo)志。Hsp90 本身在許多癌細(xì)胞中也會過量表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞相比于正常細(xì)胞，更能適應(yīng)惡劣環(huán)境。
[0004] 在眾多的Hsp90的輔助伴侶分子中，細(xì)胞分裂周期蛋白（cell division cycle protein，Cdc) Cdc37可以特異性地輔助Hsp90和多種蛋白激酶的結(jié)合，Hsp90和Cdc37的 相互作用是Hsp90和底物蛋白相互結(jié)合所必須的。人的Cdc37蛋白可以分成C端結(jié)構(gòu)域， 中間結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域，其中C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑dc37與Hsp90的相互作用至關(guān)重要，而N 端結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)和激酶等底物蛋白的催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合。而在癌癥細(xì)胞中，Hsp90和Cdc37 的表達(dá)量明顯上調(diào)。如Cdc37在正常前列腺上皮細(xì)胞中不表達(dá)，而在前列腺腫瘤中高度表 達(dá)。許多的HSP90客戶都是致癌蛋白激酶，Hsp90/Cdc37復(fù)合物在致癌蛋白激酶的成熟和活 性調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵的作用，當(dāng)過度激活時這些蛋白可以導(dǎo)致癌癥。目前研宄發(fā)現(xiàn)，Cdc37可 以將一些底物蛋白運(yùn)輸至Hsp90復(fù)合物，在Hsp90的作用下這些蛋白正確折疊，以及正常功 能的行使。當(dāng)敲掉Cdc37時，Hsp90的一些與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡以及重要 信號通路相關(guān)的底物蛋白的表達(dá)水平會有明顯的下降，這使得這一復(fù)合物成為非常重要的 癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。當(dāng)前在臨床試驗(yàn)中已有20種小分子Hsp90抑制劑用于抗腫瘤研宄。 本發(fā)明中提出的原位鄰位連接技術(shù)在細(xì)胞水平進(jìn)行高通量藥物篩選，尋找能夠破壞Hsp90 和Cdc37相互作用的小分子化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是：提供一種采用鄰位連接技術(shù)在細(xì)胞水平篩選破壞 Hsp90和Cdc37相互作用藥物的方法，這種藥物可以應(yīng)用到抗癌治療。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 提供一種抗癌藥物的篩選方法，該方法的具體步驟如下： I將抗小鼠IgG抗體和抗兔IgG抗體的N端修飾NHS基團(tuán)后，分別與5'端修飾有疊 氮基團(tuán)的單鏈Arml (SEQIDNO:l)、Arm 2 (SEQIDNO:2)偶聯(lián)，形成探針1、探針2; II培養(yǎng)Panel胰腺癌細(xì)胞株，將待篩選的藥物分別加入已貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，形 成不同藥物處理實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置沒有加任何藥物的對照組； III藥物作用結(jié)束后，加入特異性針對Hsp90的兔抗以及特異性針對Cdc37的鼠抗，后 加入步驟I中制備的探針1和探針2與上述兔抗和鼠抗進(jìn)行反應(yīng)； 1￥反應(yīng)結(jié)束后，加入長單鏈連接〇嫩(3￡〇10勵:3)和短單鏈連接0嫩(3￡〇10勵:4)， 連接反應(yīng)緩沖液以及T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)反應(yīng)，然后加入DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液，進(jìn) 行滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，結(jié)束后加入熒光檢測單鏈DNA(SEQIDNO:5)以及細(xì)胞核染料DNA雜交及 單熒光信號堆積，最后在普通熒光顯微鏡下觀察； V以對照組為參照，篩選出熒光信號減少的實(shí)驗(yàn)組，該組別所加藥物即為所需抗癌藥 物。
[0007] 其中，步驟11中Panel胰腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)于24孔板中，細(xì)胞密度為2X 105個/每 孔，所加待篩選的藥物的濃度為10 UM，加入藥物后37°C作用1小時，而藥物作用后的細(xì)胞 可固定于玻片上，而步驟1：[1中，加入特異性針對Hsp90的兔抗以及特異性針對Cdc37的鼠 抗的反應(yīng)條件為：4°C過夜。步驟IV中加入長單鏈連接DNA(SEQ ID N0:3)和短單鏈連接 DNA(SEQ ID N0:4)，連接反應(yīng)緩沖液以及T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)的反應(yīng)條件為：37°C反應(yīng) 30min，加入DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)的反應(yīng)條件是：37°C反應(yīng)90min。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次將原位鄰位連接技術(shù)應(yīng)用于抗癌藥物的篩選， 這種高通量的藥物篩選方法能夠在單細(xì)胞水平準(zhǔn)確定位和定量Hsp90和Cdc37的相互作 用，精確反映其相互作用的變化，在接近體內(nèi)的環(huán)境進(jìn)行藥物篩選，靈敏度高，不存在自熒 光的干擾，在抗癌藥物制備方面具備廣闊前景。
【附圖說明】
[0009] 圖1:抗癌藥物篩選流程的模式圖 圖2:利用鄰位連接技術(shù)篩選能夠破壞Hsp90和Cdc37相互作用的藥物統(tǒng)計(jì)圖 圖3 :雷公藤紅素處理胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anel后熒光顯微鏡下的成像圖，其中雷公藤紅素 處理后點(diǎn)數(shù)明顯的減少
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面將結(jié)合說明書附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0011] 本發(fā)明應(yīng)用合成鄰位連接技術(shù)所需要的偶聯(lián)DNA、連接DNA、及檢測引物。首先通 過化學(xué)鍵在兩種種屬性抗體上偶聯(lián)兩個探針DNA，并與另外兩條DNA -起孵育雜交成環(huán)，通 過滾環(huán)復(fù)制將DNA信號不斷擴(kuò)大，再加入帶熒光標(biāo)記的檢測引物，將蛋白質(zhì)相互作用的信 號轉(zhuǎn)換成在顯微鏡下可觀察到的熒光信號。下面以最近已發(fā)現(xiàn)的一種能夠破壞Hsp90和 Ccd37相互作用的小分子化合物一雷公藤紅素為例，系統(tǒng)介紹基于原位鄰位連接技術(shù)在 新型藥物篩選方面的應(yīng)用。
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