一種棉花黃萎病抗病性的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于棉花抗病性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棉花黃萎病抗病性的檢測(cè)方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃萎病是一種毀滅性土傳維管束病害，可侵染多種草本作物、木本作物、花丼及木 本觀賞植物。棉花黃萎病是世界性的棉花重要病害之一，一般在幼苗期幾乎不會(huì)出現(xiàn)，生 長(zhǎng)中后期棉花現(xiàn)蕾后田間大量發(fā)病，容易導(dǎo)致整個(gè)植株枯死或萎蔫。棉花黃萎病的病原為 大麗花輪枝菌和黑白輪枝菌，由于其致病因子種類繁多，變異較快，抗病遺傳規(guī)律又尚未 明確，因此選育抗病品種是防治棉花黃萎病最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，棉花黃萎病抗病品種 (系）對(duì)棉花品種的產(chǎn)量和品質(zhì)具有很大的影響。在棉花黃萎病研宄及選育抗病品種的過(guò) 程中，黃萎病抗性鑒定是病原菌致病性分化、寄主抗性遺傳、抗病機(jī)制抗病種質(zhì)篩選、抗病 品種（系）選育等研宄工作的重要基礎(chǔ)，
[0003] 目前，較常用的棉花黃萎病抗病性的檢測(cè)鑒定方法主要是人工病圃或自然重病田 進(jìn)行成株期鑒定，該方法主要依賴于植株發(fā)病情況進(jìn)行鑒定，接近生產(chǎn)實(shí)際，可對(duì)棉花黃萎 病進(jìn)行全程檢測(cè)，是棉花品種從區(qū)域試驗(yàn)走向生產(chǎn)、對(duì)黃萎病抗性進(jìn)行把關(guān)鑒定的最準(zhǔn)確 有效的方法。但是，棉花成株期檢測(cè)鑒定所需時(shí)間長(zhǎng)和占據(jù)空間多，不適合大批量材料的抗 黃萎病篩選工作，且受到土壤菌量、溫度、濕度等多種環(huán)境條件的影響和季節(jié)的限制，穩(wěn)定 性和重復(fù)性較差。如何在快速、準(zhǔn)確的對(duì)棉花黃萎病抗病性進(jìn)行苗期檢測(cè)鑒定，是急需解決 的問(wèn)題；通過(guò)對(duì)棉花黃萎病抗病性的檢測(cè)，可進(jìn)行科學(xué)快速的棉花育種，進(jìn)而獲得對(duì)黃萎病 具有高抗病性的棉花新品種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種快速、準(zhǔn)確的棉花黃萎病抗病性的檢測(cè)方法，無(wú)需等待 棉苗發(fā)病，即可判斷棉花黃萎病抗病性。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0006] -種棉花黃萎病抗病性的檢測(cè)方法，包括將黃萎病病菌接種至棉苗，檢測(cè)接種后 棉苗葉片中的幾丁質(zhì)酶活性和/或葡聚糖酶活性，并根據(jù)棉苗中幾丁質(zhì)酶活性和/或葡聚 糖酶活性判斷棉花黃萎病抗病性。
[0007] 根據(jù)棉苗中幾丁質(zhì)酶（CHI)活性和/或葡聚糖酶（GLU)活性判斷棉花黃萎病抗病 性是指根據(jù)幾丁質(zhì)酶酶活力單位和/或葡聚糖酶酶活力單位的量判斷棉花黃萎病抗病性。
[0008] 所述幾丁質(zhì)酶酶活力單位，是以樣品中每毫克蛋白中l(wèi)min內(nèi)由CHI(幾丁質(zhì)酶， chitinase)催化反應(yīng)生成的N-乙酰氨基葡萄糖量（N-乙酰葡萄糖胺）定義為一個(gè)酶活力 單位。所述葡聚糖酶酶活力單位，是以每分鐘水解0 -葡聚糖產(chǎn)生1Umol還原糖（以葡萄 糖計(jì)）所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位。
[0009] 所述棉花黃萎病抗病性的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：
[0010] 幾丁質(zhì)酶酶活力單位>36. 1，和/或葡聚糖酶酶活力單位>90. 8,為免疫材料；
[0011] 幾丁質(zhì)酶酶活力單位為32. 2~36. 1，和/或葡聚糖酶酶活力單位為78. 3~90. 8， 為尚抗材料；
[0012] 幾丁質(zhì)酶酶活力單位為28. 7~32. 1，和/或葡聚糖酶酶活力單位為67. 3~78. 2， 為抗病材料；
[0013] 幾丁質(zhì)酶酶活力單位為25. 9~28. 6,和/或葡聚糖酶酶活力單位為58. 0~67. 2， 為耐病材料；
[0014] 幾丁質(zhì)酶酶活力單位為24. 7~25. 8,和/或葡聚糖酶酶活力單位為53. 9~57. 9， 為易感材料；
[0015] 幾丁質(zhì)酶酶活力單位為〈24. 7,和/或葡聚糖酶酶活力單位為〈53. 9,為感病材料。
[0016] 所述酶活力單位的結(jié)果數(shù)值保留一位小數(shù)。
[0017] 所述免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料、易感材料、感病材料的棉花黃萎病 抗病性依次降低。除感病材料以外，所述免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料、易感材 料在生產(chǎn)上可以應(yīng)用；但用于品種選育時(shí)，選擇劃分為耐病材料及以上的指標(biāo)范圍（免疫 材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料）。
[0018] 所述的判斷標(biāo)準(zhǔn)中，為減少操作和節(jié)約成本，可單獨(dú)檢測(cè)幾丁質(zhì)酶活性或葡聚糖 酶活性進(jìn)行初步判斷，檢測(cè)結(jié)果達(dá)耐病等級(jí)以下指標(biāo)時(shí)，不再進(jìn)行另一指標(biāo)檢測(cè)；檢測(cè)結(jié)果 達(dá)抗性水平以上時(shí)，再增加另一檢測(cè)指標(biāo)，優(yōu)選兩項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)達(dá)標(biāo)才最終判定其相應(yīng)等級(jí)。
[0019] 對(duì)于同一種檢測(cè)對(duì)象，當(dāng)幾丁質(zhì)酶活性與葡聚糖酶活性的檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)不同的材 料等級(jí)時(shí)，以相對(duì)較低的等級(jí)作為該材料的對(duì)應(yīng)等級(jí)。即兩項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)沖突時(shí)， 本著從嚴(yán)從重的原則，以相對(duì)較低等級(jí)判定所檢測(cè)材料的對(duì)應(yīng)等級(jí)。
[0020] 優(yōu)選的，所述檢測(cè)方法中，檢測(cè)接種后棉苗葉片中的幾丁質(zhì)酶活性和葡聚糖酶活 性，并根據(jù)棉苗中幾丁質(zhì)酶活性和葡聚糖酶活性判斷棉花黃萎病抗病性。
[0021] 所述接種方法為傷根蘸菌液法，包括將棉苗主根剪掉1~3cm后，將棉苗的剪切傷 口浸入黃萎病病菌菌液中7~10s進(jìn)行接種。
[0022] 所述傷根蘸菌液法在室內(nèi)進(jìn)行，對(duì)棉苗無(wú)損害，植株成活率高，接種方便快捷；后 期黃萎病發(fā)病較快速、穩(wěn)定和明顯。
[0023] 所述接種是當(dāng)棉苗長(zhǎng)至兩片真葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行接種。
[0024] 所述棉苗是由以下方法制備的：取棉籽，在育苗穴盤內(nèi)進(jìn)行單粒播種后，覆蓋滅菌 后的基質(zhì)至基質(zhì)層厚lcm，再蓋土至土層厚為2cm;出苗期間保證水分充足；出苗后，控制環(huán) 境晝夜溫度為25~30 °C。
[0025] 育苗所用的棉籽，選擇顆粒飽滿均勻、適宜當(dāng)?shù)氐淖匀粭l件、質(zhì)量達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的 優(yōu)良種子。
[0026] 接種時(shí)，將育苗穴盤取出，從穴盤下面直接將外露的主根剪切l(wèi)-3cm再進(jìn)行接種 操作。
[0027] 所述育苗穴盤中單穴直徑3cm、高3cm。
[0028] 所述基質(zhì)為草炭土。使用草炭土便于棉苗的健壯生長(zhǎng)，和接種后方便帶土移栽 (容易抱團(tuán)）；草炭土高壓滅菌后備用。
[0029] 所述黃萎病病菌為中等致病力黃萎病病原菌。
[0030] 所述黃萎病病菌為黃萎病病菌VD-1。
[0031] 所述黃萎病病菌菌液中，黃萎病病菌孢子的濃度為107個(gè)/ml。
[0032] 所述黃萎病病菌菌液是由以下方法制備的：將黃萎病病菌接種至PDA固體培養(yǎng) 基，培養(yǎng)3~7天后轉(zhuǎn)入PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至菌液中黃萎病病菌孢子的濃度為107個(gè) /ml，4°C冷藏備用。
[0033] 所述PDA固體培養(yǎng)基中，馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂與水的質(zhì)量比為200:10~20:17~ 20:1000。
[0034] 所述PDA液體培養(yǎng)基中，馬鈴薯、葡萄糖與水的質(zhì)量比為200:10~20:1000。
[0035] PDA培養(yǎng)基對(duì)于棉花黃萎病病菌VD-1菌種的生長(zhǎng)和孢子的繁殖具有十分快速有 效的作用。
[0036] 接種后的棉苗繼續(xù)育苗，接種后72h時(shí)進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性和/或葡聚糖酶活性檢 測(cè)。
[0037] 所述檢測(cè)是檢測(cè)棉苗葉片中的幾丁質(zhì)酶活性和/或葡聚糖酶活性。
[0038] 所述幾丁質(zhì)酶活性的檢測(cè)方法為Reissing法。
[0039] 所述Reissing法包括下列步驟：
[0040] a)酶樣制備：取