專利名稱：Itpka基因及其表達(dá)蛋白在制備及篩選抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ITPKA基因及其表達(dá)蛋白在制備及篩選抗癌藥物中的應(yīng)用，特別是 ITPKA基因及其表達(dá)蛋白在制備及篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是目前人類主要致死疾病之一，其致死率在各種疾病中排在前三位。全世界每年有數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的人死于腫瘤，給人類的健康、社會(huì)的發(fā)展造成了難以挽回的重大損失。 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，在我國(guó)腫瘤發(fā)病率居高不下，目前有癌癥患者接近一千萬(wàn)人，死亡率高達(dá)30%，并且新增患者數(shù)目急劇增加。腫瘤發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的主要原因。因此有效地抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移對(duì)于提高腫瘤的治療效果和患者的存活率具有至關(guān)重要的作用。目前臨床治療腫瘤的主要方法如手術(shù)切除、放療和化療都不能有效地抑制腫瘤對(duì)臨近組織的侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，并且放療和化療過(guò)程嚴(yán)重?fù)p害人體的正常細(xì)胞， 從而導(dǎo)致癌癥的死亡率居高不下，五年存活率僅不到30%。研究可以有效抑制腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的新方法，成為攻克腫瘤疾病，有效治療腫瘤的新途徑。隨著對(duì)于腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制和原理研究的深入，利用生物醫(yī)學(xué)的方法治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移取得了顯著進(jìn)展， 特別是針對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中重要分子的靶向治療方法成為最有研究潛力的熱門領(lǐng)域。發(fā)現(xiàn)重要的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)志性靶分子，是有效實(shí)現(xiàn)靶向治療的重要前提。關(guān)于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，它們參與或調(diào)控了腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程， 并且針對(duì)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了新藥。但是目前應(yīng)用于抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的藥物仍遠(yuǎn)不能滿足臨床的需要，因此研制新型抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移藥物具有十分重要的意義。目前沒(méi)有ITPKA蛋白在腫瘤治療靶標(biāo)方面的研究報(bào)道。制備或篩選能夠有效抑制腫瘤臨近組織侵襲和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的藥物，關(guān)鍵是找到有效的靶向蛋白。在找到有效蛋白作為靶標(biāo)的前提條件下，才能通過(guò)篩選的方法和策略獲得高度特異性結(jié)合靶蛋白的靶向藥物。此外，篩選出的靶向藥物的藥效是否理想也是直接取決于靶蛋白在生理過(guò)程中發(fā)揮的功能。因此，篩選治療腫瘤的藥物關(guān)鍵是找到有效蛋白作為靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ITPKA基因及其表達(dá)蛋白在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。術(shù)語(yǔ)解釋ITPKA蛋白人體內(nèi)表達(dá)的肌醇l，4，5-trisphosphate 3激酶A。表達(dá)蛋白=ITPKA基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后的蛋白因子，即ITPKA蛋白。發(fā)明概述本發(fā)明基于發(fā)明人的以下的幾個(gè)方面的發(fā)現(xiàn)作為前提ITPKA基因是一個(gè)在神經(jīng)元和睪丸中特異性表達(dá)，在其他組織中不表達(dá)的微絲成束蛋白的基因片斷。但是在多種常見(jiàn)的癌癥如肺癌等發(fā)病初期，ITPKA蛋白發(fā)生急劇高水平異位表達(dá)并且是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的重要作用蛋白。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)癌細(xì)胞中IPTKA蛋白表達(dá)水平顯著提高時(shí)， 癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，形成由大量肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架構(gòu)成的突出物，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)；反之，當(dāng)顯著降低癌細(xì)胞中ITPKA蛋白表達(dá)水平時(shí)，癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力隨之降低或消失。在癌癥治療過(guò)程中，ITPKA蛋白的表達(dá)水平與臨床抗癌藥物抑制腫瘤發(fā)展的治療效果呈顯著相關(guān)。ITPKA蛋白作為腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，參與了腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，因此可以用作臨床腫瘤診斷和/或治療中的靶向蛋白，用于檢測(cè)抗癌藥效及篩選制備抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新型藥物。ITPKA蛋白促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移主要是通過(guò)以下兩種機(jī)制完成的(1)不依賴于細(xì)胞生長(zhǎng)因子的方式ITPKA蛋白通過(guò)直接調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架， 誘導(dǎo)細(xì)胞形成大量的突出物如絲狀偽足以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。(2)在受到生長(zhǎng)因子激發(fā)的細(xì)胞中，ITPKA蛋白通過(guò)催化產(chǎn)生大量的1，3，4，5_四磷酸肌醇并抑制肌醇磷酸-5-磷酸酶的活性等方式使細(xì)胞中大量鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)一步增強(qiáng)了 ITPKA蛋白誘發(fā)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。發(fā)明詳述本發(fā)明技術(shù)方案如下ITPKA基因在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。抑制ITPKA基因表達(dá)的基因片段shRNAl，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。抑制ITPKA基因表達(dá)的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述基因片段shRNAl和/或基因片段shRNA2在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。ITPKA蛋白在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，ITPKA蛋白作為制備或篩選治療腫瘤藥物的靶向蛋白。ITPKA蛋白作為腫瘤靶向蛋白篩選用于腫瘤治療的藥物，篩選得到的抗腫瘤藥物可以是單克隆抗體，或者其他類型的與ITPKA蛋白結(jié)合的分子，如多肽或小分子藥物等。此外，可以將一些治療性物質(zhì)偶聯(lián)于與ITPKA具有高親和力的靶向藥物上以達(dá)到治療的效果，如將放射性核素偶聯(lián)于抗ITPKA蛋白的單克隆抗體上，這些技術(shù)均為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。ITPKA蛋白的抗體在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用
上述ITPKA蛋白的抗體為ITPKA蛋白的單克隆抗體，制備步驟如下(1)利用ITPKA蛋白免疫動(dòng)物，獲得免疫血清；(2)測(cè)定步驟(1)制得的免疫血清中抗ITPKA蛋白的抗體的有效濃度，收集滴度達(dá)到IO8以上的免疫血清；(3)利用ITPKA蛋白對(duì)步驟⑵制得的免疫血清進(jìn)行抗原親和層析純化，得到特異性識(shí)別目標(biāo)靶蛋白ITPKA蛋白的抗體。所述測(cè)定為間接ELISA法測(cè)定。所述ITPKA蛋白，制備步驟如下1)利用ITPKA cDNA連接pET28b載體構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽(yáng)性克隆菌株；2)將陽(yáng)性菌株接種在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床200rpm
4過(guò)夜培養(yǎng)；然后按體積比1 100的比例稀釋到含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C搖床200rpm培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)菌液OD6tltl值達(dá)到0. 6-0. 8時(shí)，加入終濃度為400mM的 IPTG誘導(dǎo)劑，16°C搖床200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)20h，離心收集誘導(dǎo)菌體；3)將步驟( 制得的誘導(dǎo)菌體重懸后，利用超聲波方法破碎，離心，將上清液通過(guò)鎳親和層析柱方法純化得到高純度的ITPKA蛋白，將得到的ITPKA蛋白在50mM KCl、5mM Tris-HClpH 8. 0的緩沖液中透析，即得。上述腫瘤細(xì)胞為皮膚癌、肺癌、乳腺癌或肝癌細(xì)胞，優(yōu)選皮膚癌細(xì)胞。根據(jù)業(yè)內(nèi)共知的規(guī)律，本發(fā)明所述的技術(shù)方案可以用于高表達(dá)ITPKA蛋白癌癥的治療及藥物篩選。有益效果本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要參與靶向蛋白ITPKA蛋白。在臨床診斷和治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，結(jié)合本發(fā)明的技術(shù)方案可以將ITPKA蛋白作為腫瘤標(biāo)記分子、抗癌藥效檢測(cè)標(biāo)記分子和癌癥治療的靶向蛋白進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明為制備抗癌藥物及抗癌藥物的篩選提供了新的途徑。


圖1、利用ITPKA蛋白多抗免疫組化的方法對(duì)正常組織和肺癌組織、乳腺癌組織、 肝癌組織中的ITPKA蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的柱狀圖；圖2、用ITPKA蛋白多抗免疫組化檢測(cè)人體肺癌附近正常組織、肺癌組織中心、肺癌侵襲前沿和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的電子顯微鏡照片；其中A、癌旁正常組織；B、癌中心；C、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移；圖3、顯示用ITPKA蛋白多抗免疫組化檢測(cè)人體肺癌附近正常組織、肺癌組織中心、肺癌侵襲前沿和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)情況的柱狀圖；圖4、ITPKA蛋白多抗免疫組化檢測(cè)不同抗癌藥物治療效果與其抑制ITPKA表達(dá)能力的相關(guān)性的柱狀圖；圖5A、基因片段shRNAl和基因片段shRNA2抑制腫瘤細(xì)胞YES2侵襲轉(zhuǎn)移能力的柱狀圖；圖5B、基因片段shRNAl和基因片段shRNA2抑制腫瘤細(xì)胞EC9706-P4侵襲轉(zhuǎn)移能力的柱狀圖；圖5C、基因片段shRNAl和基因片段shRNA 2抑制腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染裸鼠體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移能力，其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染鼠生存天數(shù)的柱狀圖；圖6A、濃度梯度的兔免疫血清和純化ITPKA鼠多抗蛋白抑制腫瘤細(xì)胞遷移能力的柱狀圖；圖6B、濃度梯度的兔免疫血清和純化ITPKA鼠多抗蛋白抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠肺中形成病灶能力的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例1腫瘤抗原的制備利用分子生物學(xué)的方法，通過(guò)如下方法表達(dá)并純化得到了 ITPKA蛋白
(1)提取神經(jīng)元組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得組織cDNA序列。設(shè)計(jì)ITPKA特異的引物， 引物序列正向引物 GAATTCATGACCCTGCCCGGGGC ；反向引物 AAGCTTTCATCTCTCAGCCAGGCTGG。 PCR 條件第一步 95°C 5min，第二步 94°C 30sec，第三步 59°C 30sec，第四步 72°C 90sec，第二到第四步30個(gè)循環(huán)，72°C IOmin0克隆得到了 ITPKA基因的cDNA編碼序列。通過(guò)DNA測(cè)序的方法確認(rèn)序列完全正確。(2)將ITPKA基因的cDNA編碼序列導(dǎo)入pET28b載體構(gòu)建表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21DE3 ；(3)在上述大腸桿菌BL21DE3中添加誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)ITPKA蛋白在宿主細(xì)胞中大
量表達(dá)；(4)利用超聲波等方法破碎細(xì)胞并通過(guò)親和層析柱等方法純化得到高純度的 ITPKA蛋白。表達(dá)得到的ITPKA蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。實(shí)施例2ITPKA蛋白多克隆抗體的制備(1)利用實(shí)施例1中表達(dá)的ITPKA蛋白作為抗原免疫實(shí)驗(yàn)鼠制備抗ITPKA蛋白的多克隆抗體取免疫前血清免疫前自鼠耳靜脈取血備檢，第一次免疫ITPKA蛋白與弗氏佐劑按1:1比例充分混合后，經(jīng)皮內(nèi)注射免疫實(shí)驗(yàn)鼠，每只500 μ g多肽KLH偶聯(lián)物(購(gòu)自德國(guó)默克公司)；第二次免疫第一次免疫兩周后，取500 μ g ITPKA蛋白與弗氏不完全佐劑充分混合后再次經(jīng)皮內(nèi)注射免疫實(shí)驗(yàn)鼠；注射卡介苗第二次免疫后7d，按每只鼠100毫克卡介苗經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫實(shí)驗(yàn)鼠；第三次免疫自注射卡介苗后1 ld，按每只鼠500 μ g ITPKA蛋白與弗氏不完全佐劑充分混合后經(jīng)淋巴結(jié)注射免疫實(shí)驗(yàn)鼠；(2)效價(jià)測(cè)定第三次免疫后9到10天自鼠靜脈取血，用來(lái)測(cè)定免疫血清的抗體滴度，當(dāng)免疫血清中目標(biāo)抗體的滴度達(dá)到IO8以上時(shí)，自鼠靜脈取血，置于直徑為150mm的干凈平皿中，4度過(guò)夜；第二天，離心分離血清，得到免疫血清；(3)由于獲得的免疫血清中還含有大量的非特異性的免疫球蛋白，直接用免疫血清進(jìn)行免疫組化等實(shí)驗(yàn)將產(chǎn)生大量的非特異性干擾信號(hào)，影響對(duì)檢測(cè)的結(jié)果的判斷，因此我們用偶聯(lián)有ITPKA的纖維素膜進(jìn)行親和層析的方法純化得到了與ITPKA蛋白特異性結(jié)合的抗體。實(shí)施例3利用組織芯片檢測(cè)ITPKA蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)升高石蠟包埋的皮膚癌組織制備組織芯片，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。5%過(guò)氧化氫室溫10分鐘，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。切片在枸櫞酸緩沖液 (10mM,pH6. 5)中用微波加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)。用20%正常山羊血清室溫封閉20分鐘。棄封閉液，加入1-2微克每毫升抗ITPKA蛋白多克隆抗體，4度孵育過(guò)夜。然后用PBS洗5遍， 每遍5分鐘，加入HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育1小時(shí)。利用染料DAB染色，及蘇木素復(fù)染，封片后在顯微鏡下觀察檢測(cè)結(jié)果。ITPKA蛋白的表達(dá)在皮膚癌組織中高水平異位表達(dá)。而且ITPKA蛋白在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理期呈顯著正相關(guān) (表 1)。
表1在58例皮膚癌組織芯片中ITPKA蛋白表達(dá)水平與皮膚癌臨床病理特征的相關(guān)性
權(quán)利要求
1.ITPKA基因在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
2.抑制ITPKA基因表達(dá)的基因片段shRNAl，核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
3.抑制ITPKA基因表達(dá)的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.權(quán)利要求2所述基因片段shRNAl和/或權(quán)利要求3所述基因片段shRNA2在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
5.ITPKA蛋白在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，ITPKA蛋白作為制備或篩選治療腫瘤藥物的靶向蛋白。
7.ITPKA蛋白的抗體在制備或篩選抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述ITPKA蛋白的抗體為ITPKA蛋白的單克隆抗體，制備步驟如下(1)利用ITPKA蛋白免疫動(dòng)物，獲得免疫血清；(2)測(cè)定步驟(1)制得的免疫血清中抗ITPKA蛋白的抗體的有效濃度，收集滴度達(dá)到 IO8以上的免疫血清；(3)利用ITPKA蛋白對(duì)步驟⑵制得的免疫血清進(jìn)行抗原親和層析純化，得到特異性識(shí)別目標(biāo)靶蛋白ITPKA蛋白的抗體。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟(2)中的測(cè)定為間接ELISA法測(cè)定。
10.權(quán)利要求1、4-9中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為皮膚癌、肺癌、乳腺癌或肝癌細(xì)胞，優(yōu)選皮膚癌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及ITPKA基因及其表達(dá)蛋白在制備及篩選抗癌藥物中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供抑制ITPKA基因表達(dá)的基因片段shRNA1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；抑制ITPKA基因表達(dá)的基因片段shRNA2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明為制備抗癌藥物及抗癌藥物的篩選提供了新的途徑。
文檔編號(hào)C07K16/40GK102389574SQ20111028200
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者謝鈺容 申請(qǐng)人:謝鈺容