用于檢測(cè)fmdv、vsv、svdv、pprv和btv的基因芯片及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物芯片領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、 豬水皰病病毒、小反合獸疫病毒和藍(lán)舌病病毒的基因芯片及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)、水皰性口炎（Vesicular stomatitis， VS)、豬水皰?。⊿wine vesicular disease，SVD)、小反合獸疫（peste des petits ruminants，PPR)和藍(lán)舌?。˙luetongue disease, BT)分別由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、水皰性口 炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV)、豬水皰 病病毒（Swine vesicular disease virus，SVDV)、小反合獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV)和藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus, BTV)引起的急性、烈性病毒性 傳染病。FMDV、VSV、SVDV、PPRV和BTV五種病毒廣泛流行于世界各地，宿主范圍廣，發(fā)病率 高，均為妨礙畜牧業(yè)發(fā)展的重要疫病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（0IE)將其均列為法定報(bào)告疫病， 我國(guó)也將其列為一類(lèi)傳染病?？谔阋摺⑺捫钥谘缀拓i水皰病均可感染豬，且以蹄部、口腔、 乳房等出現(xiàn)皰瘆為主要臨床癥狀。藍(lán)舌病和小反芻獸疫主要感染山羊、綿羊、牛等，患病動(dòng) 物的乳房和蹄部也出現(xiàn)病變。五種病毒感染易感動(dòng)物可出現(xiàn)相似的臨床癥狀，因此不能通 過(guò)臨床癥狀進(jìn)行區(qū)分，必須進(jìn)行病原學(xué)鑒別診斷。因而在動(dòng)物及其副產(chǎn)品的進(jìn)出口檢疫時(shí)， 對(duì)相應(yīng)病毒的檢測(cè)有著重要的意義。
[0003] 近年來(lái)，隨著全球一體化的加快，不斷擴(kuò)大的國(guó)際貿(mào)易為動(dòng)物疫病的擴(kuò)散增加了 機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)的病原分離鑒定和血清學(xué)方法，耗時(shí)長(zhǎng)，需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，已不能完全滿 足進(jìn)口動(dòng)物疫病的快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)要求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)，但目前缺乏可區(qū)分幾種病毒的PCR方法。此外，F(xiàn)MDV、 VSV、SVDV、PPRV和BTV五種病毒均為RNA病毒，RNA易降解、不穩(wěn)定性一定程度上增加病原 診斷的難度?；蛐酒℅ene chip)是由DNA或寡核苷酸探針密集排列在經(jīng)過(guò)共價(jià)結(jié)合醛 基、氨基或多聚賴氨酸的固相支持物所形成的探針陣列，在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度條件下，利用 特異性探針與經(jīng)過(guò)適當(dāng)方式標(biāo)記的待檢樣品DNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交，然后通過(guò)相應(yīng)的 檢測(cè)設(shè)備，檢測(cè)雜交信號(hào)的位置和強(qiáng)弱，判斷樣品種類(lèi)，完成疾病檢測(cè)和基礎(chǔ)研宄等方面 的工作。該方法具有高通量、平行化、微量化、自動(dòng)化、低成本的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合基因芯片的優(yōu)勢(shì)， 建立一種快速檢測(cè)鑒別口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒、藍(lán)舌病病毒和小反芻 獸疫病病毒的基因芯片技術(shù)，可滿足進(jìn)出口動(dòng)物疫病的快速、準(zhǔn)確診斷，有效防止動(dòng)物疫病 通過(guò)國(guó)際貿(mào)易擴(kuò)散傳播。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、節(jié)時(shí)省力并且易于觀察結(jié)果的微 陣列芯片檢測(cè)口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒、小反芻獸疫病毒和藍(lán)舌病病毒 的基因芯片。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：用于口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、 豬水皰病病毒、小反芻獸疫病毒和藍(lán)舌病病毒的基因芯片檢測(cè)裝置，包括：PCR反應(yīng)混合液 管、Taq聚合酶、PCR陽(yáng)性對(duì)照、PCR陰性對(duì)照、ddH 20、檢測(cè)芯片、芯片探針的點(diǎn)樣分布、口蹄 疫病毒A型一條檢測(cè)探針的核苷酸序列、口蹄疫病毒亞洲I型一條檢測(cè)探針的核苷酸序列、 口蹄疫病毒〇型一條檢測(cè)探針的核苷酸序列、口蹄疫病毒通用型一條檢測(cè)探針的核苷酸序 列、水皰性口炎病毒一條檢測(cè)探針的核苷酸序列、豬水皰病病毒一條檢測(cè)探針的核苷酸序 列、藍(lán)舌病病毒一條檢測(cè)探針的核苷酸序列、小反芻獸疫病毒一條檢測(cè)探針的核苷酸序列、 芯片蓋片、雜交液、雜交陽(yáng)性對(duì)照、雜交盒。
[0006] 采用基因芯片微量點(diǎn)樣技術(shù)，將待測(cè)樣品探針與各種質(zhì)控探針固定在經(jīng)過(guò)化學(xué)修 飾的基片上，形成的微陣列。微陣列包括質(zhì)控探針區(qū)和待測(cè)樣品探針區(qū)，其中所述質(zhì)控探針 區(qū)內(nèi)設(shè)置下述分區(qū)：
[0007] 點(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)P1，包含至少一個(gè)點(diǎn)樣位置質(zhì)控探針：SEQ ID NO. 9 ;
[0008] 雜交陽(yáng)性質(zhì)控分區(qū)P2,包含至少一個(gè)雜交陽(yáng)性質(zhì)控探針：SEQ ID NO. 10 ;
[0009] 雜交陰性質(zhì)控分區(qū)N，包含點(diǎn)樣緩沖液；
[0010] 所述待測(cè)樣品探針區(qū)內(nèi)設(shè)置下述包括至少一個(gè)待測(cè)樣品探針的分區(qū)：
[0011] 口蹄疫病毒A型探針?lè)謪^(qū)，
[0012] 口蹄疫病毒亞洲I型探針?lè)謪^(qū)，
[0013] 口蹄疫病毒通用型探針?lè)謪^(qū)，
[0014] 口蹄疫病毒0型探針?lè)謪^(qū)，
[0015] 水皰性口炎病毒探針?lè)謪^(qū)，
[0016] 豬水皰病病毒探針?lè)謪^(qū)，
[0017] 藍(lán)舌病病毒探針?lè)謪^(qū)，
[0018] 小反芻獸疫病毒探針?lè)謪^(qū)；
[0019] 各個(gè)探針序列如下：
[0020] 口蹄疫病毒A型探針：SEQ ID NO. 1 ;
[0021] 口蹄疫病毒亞洲I型探針：SEQ ID NO. 2 ;
[0022] 口蹄疫病毒通用型探針：SEQ ID NO. 3
[0023] 口蹄疫病毒0型探針：SEQ ID NO. 4 ;
[0024] 水皰性口炎病毒探針：SEQ ID NO. 5 ;
[0025] 豬水皰病病毒探針：SEQ ID NO. 6 ;
[0026] 藍(lán)舌病病毒探針：SEQ ID NO. 7 ;
[0027] 小反芻獸疫病毒探針：SEQ ID NO. 8。
[0028] 利用上述基因芯片檢測(cè)口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒、小反芻獸疫 病毒和藍(lán)舌病病毒的檢測(cè)方法，具體步驟如下：
[0029] (1)待測(cè)樣品制備：按照商品化RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取待檢組織或病毒 的細(xì)胞增殖液的全基因組，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備待測(cè)樣品cDNA;
[0030] (2)?0?擴(kuò)增：25 1^?0?反應(yīng)液包含：1^&9酶12.5 1^、引物組17.8 1^、待測(cè)樣 品DNA 3 y L、無(wú)核酸酶滅菌水1. 7 y L;
[0031] 其中，所述引物Mix含有：
[0032] 20ymol/L 口蹄疫A型病毒特異上游引物SEQ ID NO. 11 0. 2yL，
[0033] 20ymol/L 口蹄疫A型病毒特異下游引物SEQ ID NO. 12 0. 2yL，
[0034] 20ymol/L 口蹄疫亞洲I型病毒特異上游引物SEQ ID NO. 13 0.2yL，
[0035] 20 y mol/L 口蹄疫亞洲I型病毒特異下游引物SEQ ID NO. 14 0. 2 y L，
[0036] 20 ymol/L 口蹄疫0型病毒特異上游引物SEQ ID NO. 15 0? 2 y L，
[0037] 20 ymol/L 口蹄疫0型病毒特異上游引物SEQ ID NO. 16 0. 2 y L，
[0038] 20ymol/L水皰性口炎病毒特異上游引物SEQ ID NO. 17 0. 2yL,
[0039] 20ymol/L水皰性口炎病毒特異下游引物SEQ ID NO. 18 0.2yL,
[0040] 20 ymol/L豬水皰病病毒特異上游引物SEQ ID NO. 19 0? 2 y L,
[0041] 20ymol/L豬水皰病病毒特異下游引物SEQ ID NO. 20 0? 2yL,
[0042] 20ymol/L藍(lán)舌病病毒特異上游引物SEQ ID NO. 210. 2yL,
[0043] 20ymol/L藍(lán)舌病病毒特異下游引物SEQ ID NO. 22 0? 2yL,
[0044] 20 y mol/L小反芻獸疫病毒特異上游引物SEQ ID NO. 23 0? 2 y L,
[0045] 20 y mol/L小反芻獸疫病毒特異下游引物SEQ ID NO. 24 0? 2 y L,
[0046] 20ymol/L PCR 通用上游引物 SEQ ID NO. 25 4yL，
[0047] 20 ymol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID NO. 26 1 y L ;
[0048]按如下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：94°C 5min ;94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 25sec 循環(huán) 12 次； 94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C 25sec 循環(huán) 30 次；72°C lOmin ;
[0049] (3)雜交：首先配制雜交液：雜交緩沖液7. 8 y L、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7 y L、雜交陽(yáng)性對(duì) 照0. 2 y L，混勻后95°C變性8min，冰上放置5min，然后采用15 y L雜交液進(jìn)行雜交；其中 雜交緩沖液每1000 u L包括20 X SSC 500 y L、10 % SDS 10 y L及無(wú)核酸酶滅菌水490 y L。
[0050] (4)結(jié)果判讀：用微陣列芯片掃描儀掃描分析，去除陰性對(duì)照背景，與芯片雜交說(shuō) 明對(duì)照，判定結(jié)果。
[0051] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0052](1)成功地構(gòu)建了FMDV&VSV&SVDV&BTV&PPRV檢測(cè)基因芯片：本發(fā)明所制備的基因 芯片采用的各條篩選探針可與對(duì)應(yīng)病毒目的基因進(jìn)行特異性結(jié)合，雜交信號(hào)較強(qiáng)且穩(wěn)定。
[0053] (2)制備的檢測(cè)基因芯片具有良好的方法學(xué)特征：本發(fā)明建立了一種特異性好、 靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)和節(jié)時(shí)省力的基因芯片檢測(cè)方法。
[0054](3)檢測(cè)基因芯片的構(gòu)建，為混合感染疾病的同步檢測(cè)和鑒別診斷提供快速、高效 的手段，為今后出入境動(dòng)物檢疫和相應(yīng)疫病控制提供了技術(shù)保障。對(duì)滿足進(jìn)出境動(dòng)物檢疫 工作的需要，控制口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒、小反芻獸疫病毒和藍(lán)舌病 病毒的傳播，保障我國(guó)的畜牧業(yè)安全、健康發(fā)展具有十分重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0055] 圖1芯片探針?lè)植际疽鈭D；
[0056] 圖2 口蹄