Palb2基因易感snp位點檢測組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，特別是涉及PALB2基因SNP位點檢測的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是一種嚴重影響婦女身體健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。據(jù) 資料統(tǒng)計，其發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，在婦女中僅次于子宮癌。乳腺癌的發(fā)病 常與遺傳有關(guān)，另外，40-60歲之間，絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率較高。
[0003] 乳腺癌可分為散發(fā)性和遺傳性兩大類。其中遺傳性乳腺癌約占乳癌發(fā)病率的 5% -10%。據(jù)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM)報道，研究發(fā)現(xiàn)除BRCA1/2基因以外，存在第三 種乳腺癌關(guān)鍵基因PALB2。攜帶了 PALB2基因突變的女性在年齡達到70歲以后就會有三分 之一患上乳腺癌的風(fēng)險。
[0004] PALB2基因存在于人類第16號染色體上，其編碼的蛋白在細胞修復(fù)方面有重要的 作用，PALB2基因上的能夠增加患乳腺癌的風(fēng)險，此外還有證據(jù)表明攜帶PALB2基因突變的 細胞對一類新藥敏感，這類新藥是PARP抑制劑，目前正在針對BRCA1/2相關(guān)乳腺癌進行試 用，這些藥物也有可能對PALB2相關(guān)乳腺癌起作用。如果一個女性被發(fā)現(xiàn)攜帶了這種突變， 建議其進行更多的診斷監(jiān)測，如MRI乳腺癌篩查。
[0005]目前，普遍應(yīng)用的SNP位點突變檢測方法主要有以下幾種：熒光定量PCR技術(shù)，該 技術(shù)靈敏度高、特異性強、自動化程度高，但是會存在樣品污染、假陽性高的情況，并且每次 只能檢測一種類型。限制小片段長度多態(tài)性分析法（RFLP發(fā)）用于檢測酶切位點改變的基 因，可直接判斷基因型，但是不能用于沒有產(chǎn)生新酶切位點的基因檢測；此外，RFLP實驗操 作繁瑣，檢測周期長，成本高，假陽性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測要求。DNA 一代測序法，兩端靠近引物的序列容易測不準，且測序周期較長，操作復(fù)雜，易于污染，成本 昂貴，所以該方法很難滿足實際應(yīng)用的需要。
[0006] 因此，急需能夠相對方便、快捷、檢測周期短、針對性強、檢測結(jié)果準確可靠的檢測 手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為達到上述目的，本發(fā)明提供一種PALB2基因熱點SNP位點檢測組合物，該組合物 檢測通量高且靈敏度特異性強，一次檢測能夠覆蓋372個熱點SNP位點。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：PALB2基因易感SNP位點檢測組合物，所述PALB2基因易感 SNP位點檢測組合物包括SEQ N0 :1~SEQ N0 :206的引物；
[0009] 所述SEQ N0 :1~SEQ N0 :206的引物序列見表1。
[0010] 所述SEQ N0 :1~SEQ N0 :206引物在引物panel的濃度均為100nM。
[0011] 優(yōu)選的，所述PALB2基因易感SNP位點檢測組合物的組成是：Master Mix 11 ill、 包含所述SEQ NO :1~SEQ NO :206引物的引物panel 5. 5 ill、待測DNA樣品4. 5 ill。
[0012] 優(yōu)選的，所述 Master Mix 組成為：PCR buffer (5 X) 4 u 1、MgCl2l. 5 u 1、Taq 酶 1. 5 li 1、ddH20 4 li 1。
[0013] 優(yōu)選的，所述PALB2基因易感SNP位點檢測組合物的PCR反應(yīng)條件為：首先92~ 97°C預(yù)變性3~10分鐘；然后聚合酶鏈式反應(yīng)擴增階段：92~97°C變性10~20s，50~ 65°C退火10~30s，70~75°C延伸10~20s，并進行10~15個循環(huán)。
[0014] 待測DNA樣品采用多重PCR酶進行擴增后構(gòu)建文庫與上機質(zhì)控品一起進行大規(guī)模 平行測序（二代測序），儀器獲得的結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析，得出樣本中含有的 SNP位點等信息。
[0015] 所述質(zhì)控品為加入的1% control particles。是一種商品化試劑，包含在上機測 序的試劑盒PGM Sequencing 0T2kit中，作為上機測序?qū)嶒灥膬?nèi)參，對測序情況進行評估和 質(zhì)控，如果測序結(jié)果中不包含1%的control particles結(jié)果，說明上機實驗失敗，結(jié)果不 可靠。
[0016] 所述待測DNA樣品為人類基因組DNA。
[0017] 多重PCR過程同時進行陰性對照實驗，所用陰性樣本為正常人基因組DNA。
[0018] 待測DNA樣品為人類細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細胞DNA、體液DNA或 排泄物細胞DNA。
[0019] 本發(fā)明的檢測基因為PALB2基因，包括其全部外顯子和部分內(nèi)含子中熱點SNP位 點（見表2)。
[0020] 本發(fā)明所稱的PALB2包含等372個易感SNP位點（表2)。
[0021] 本發(fā)明組合物中的引物是針對PALB2基因易感SNP位點可能的某一段序列進行設(shè) 計。引物偏向性擴增的程度低，各引物之間相互干擾性小，特異性強，擴增效果好。這些引 物以混合物形式溶解于一管中，在實驗中同時加入。
[0022] 測序反應(yīng)體系的組成為：DNA模板多重PCR反應(yīng)、模板文庫構(gòu)建、上機模板準備和 富集反應(yīng)、上機測序反應(yīng)和測試數(shù)據(jù)處理分析。
[0023] 上機模板準備和富集反應(yīng)過程包括模板油包水?dāng)U增和陽性模板富集，所述兩個過 程中試劑組成包括 Ion PGM Beads、PGM Template 0T2 Solutions、1 % control particle 等、儀器組成主要包含Ion One Touch和Ion OneTouch ES。上機模板準備和上機過程中 用到的試劑和耗材與Ion Torrent二代測序平臺相配套，包括PGM Template 0T2kit、PGM Sequencing 0T2kit、Ion 318 chip等部分。上機反應(yīng)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果通過序列篩選、拼接 和比對等方法以及生物信息學(xué)分析，最終獲得測試樣本的SNP位點信息。
[0024] 上機測序反應(yīng)過程包括PGM測序反應(yīng)過程，其原理是利用半導(dǎo)體技術(shù)來檢測合成 過程中核苷酸摻入時釋放的質(zhì)子，以此測定DNA的堿基序列。
[0025] 模板文庫構(gòu)建過程包括末端補平修復(fù)、末端連接測序接頭、模板擴增和純化，所述 反應(yīng)體系中包含〇. 2-1U末端補平酶、0. 2-1U連接酶、0. 2-1U擴增Taq酶、10_50mM測序接頭 A和Pl、10-20mM測序接頭A和P1通用引物、l-10XBuffer和0? 2-1. 8XAmpure純化磁珠 等試劑。
[0026] 所述檢測結(jié)果數(shù)據(jù)處理、生物信息學(xué)分析得出檢測基因的特定SNP位點情況。
[0027] 測試數(shù)據(jù)處理分析包括測序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換、拼接、質(zhì)控和突變位點分析等過程，通過 數(shù)據(jù)的處理最終獲得檢測樣本SNP位點的信息。
[0028] 本發(fā)明具備檢測通量高、靈敏度高、特異性高的特性，靈敏度可以達到0.01%，樣 本的DNA濃度可以低至0. 1-lng/ li 1。
[0029] SEQ NO :1~SEQ NO :206的引物序列如表1所示。
[0030] 表1 PALB2基因易感SNP位點檢測引物序列
【主權(quán)項】
1.PALB2基因易感SNP位點檢測組合物，其特征在于，所述PALB2基因易感SNP位點檢 測組合物包括SEQNO:1~SEQNO:206的引物； 所述SEQNO:1~SEQNO:206引物的序列如下：


o
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PALB2基因易感SNP位點檢測組合物，其特征在于，所述 PALB2基因易感SNP位點檢測組合物包括：MasterMix11ill、包含所述SEQNO:1~SEQ NO:206 引物的引物panel5. 5iil、待測DNA樣品 4. 5iil。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的PALB2基因易感SNP位點檢測組合物，其特征在于，所述 PALB2基因易感SNP位點檢測組合物的PCR反應(yīng)條件為：首先92~97°C預(yù)變性3~10分 鐘；然后聚合酶鏈式反應(yīng)擴增階段：92~97°C變性10~20s，50~65°C退火10~30s， 70~75°C延伸10~20s，并進行10~15個循環(huán)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了PALB2基因易感SNP位點檢測組合物，所述PALB2基因易感SNP位點檢測組合物包括SEQ NO：1～SEQ NO：206的引物。本發(fā)明能夠檢測PALB2基因372個易感SNP位點，對乳腺癌相關(guān)易感SNP位點具有檢測通量高、特異性強、不易污染、安全性高優(yōu)點，檢測結(jié)果具有較好的準確性和重復(fù)性，對乳腺癌易感人群，尤其是具有這乳腺癌家族遺傳史的人群有一定的輔助診斷和提示作用。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104694664
【申請?zhí)枴緾N201510172524
【發(fā)明人】張利清, 官民曉, 劉蕊芳, 焦淑靜, 王弢, 何素莉
【申請人】玉峰惠仁生物醫(yī)藥科技（北京）有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年4月13日