豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬輪狀病毒的快速檢測方法以及該方法在鑒 別檢測PRV與PrV、PPV、PEDV、TGEV和PRRSV中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 輪狀病毒（rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，是引起嬰幼兒和 多種幼齡動物病毒性腹瀉的主要病原體。豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PRV)是引起 仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。我國豬輪 狀病毒感染也非常普遍，有些地區(qū)斷奶仔豬陽性率高達72%。輪狀病毒基因組由11個dsRNA 片段組成，分別編碼病毒6個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP)，病毒結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定。VP6蛋 白是其重要的群抗原，屬于內(nèi)層衣殼蛋白，占病毒蛋白總量的51%，具有病毒特異性抗原決 定簇，而且在病毒的復(fù)制和裝配過程中發(fā)揮重要的作用。RV根據(jù)其基因組結(jié)構(gòu)和抗原性分 為A-G等7個組。A組、B組和C組可引起人類和動物感染，而D組、E組、F組和G組主要 引起動物感染。其中A組RV在人類和動物中感染最為普遍。
[0003] 1968年美國的Mebus等首次從犢牛糞便中分離出輪狀病毒，1973年澳大利亞學(xué)者 Bishop在胃腸炎患者的十二指腸超薄切片中也發(fā)現(xiàn)輪狀病毒，該病毒是引起嬰兒及多種幼 齡動物非菌性腹瀉的主要病原。目前，我國對PRV的診斷主要依賴于常規(guī)實驗室診斷，其操 作過程復(fù)雜耗時，并且需要昂貴的儀器。因此，建立一種敏感性高、特異性好并能應(yīng)用于早 期臨床檢測PRV的方法是十分必要的。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA) 及膠體金技術(shù)等臨床常用的檢測方法很難檢測出早期的PRV感染，且敏感性低。LAMP是 Notorni等發(fā)明的DNA擴增方法。由于RT-LAMP方法具有較高的敏感性與特異性，加之無需 特殊儀器設(shè)備、操作簡單、檢測快速等優(yōu)點，該方法己被用于檢測感染性病原體，其中包括 H5N1亞型禽流感病毒、乙型肝炎病毒和口蹄疫病毒等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種豬輪狀病毒（PRV)反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP)檢 測方法及應(yīng)用，為PRV的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的分子生物 學(xué)診斷方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種豬輪狀病毒RT-LAMP檢測方法，包括如下步驟： 一、 建立RT-LAMP反應(yīng)體系，同時設(shè)立陰性對照；所述RT-LAMP反應(yīng)體系共25 ii L，包 括：模板 2 iiL，0.8 iiMFIP 和 BIP 引物各 0.5 iiL，0.2 iiM 的 F3 和 B3 引物各 0.25 iiL， 2 uL dNTP,5 mM MgS04,8 U Bst DNA polymerase和 lXThermoPol BufTer,l uL MLV反 轉(zhuǎn)錄酶，用滅菌水體積補足至25 y L ;所述陰性對照的模板為滅菌水； 二、 在恒溫水浴鍋中61-65°C反應(yīng)20-60 min后，80°C終止20 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳鑒定或加入2 yL SYBR Green I染料，紫外燈下或肉眼觀察結(jié)果。
[0006] 本發(fā)明的豬輪狀病毒與豬A群輪狀經(jīng)典毒株0SU的VP6核苷酸同源性為86. 8%， 氨基酸同源性為97%，所以選用VP6基因序列設(shè)計RT-LAMP引物，建立了 PRV的RT-LAMP 檢測方法，該方法可用于鑒別檢測豬輪狀病毒（PRV)與豬偽狂犬病毒（PrV)、豬細小病毒 (PPV)、豬流行性腹瀉病毒（PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)和豬繁殖與呼吸綜合征病 毒（PRRSV)。
[0007] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點： 1、根據(jù)PRV DN30209株VP6基因序列設(shè)計4條RT-LAMP引物，進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，建 立能特異性擴增PRV VP6基因的RT-LAMP檢測方法，通過加入SYBR Green I紫外燈下顏色 變化判斷結(jié)果。該方法在62°C恒溫下作用40 min，使PRV VP6基因獲得了高效率的特異性 擴增，與其他豬易感病毒，如PEDV等無交叉反應(yīng)；且具有極高的靈敏性，可檢測到89. 5 fg/ UL的目標(biāo)病毒RNA，比普通PCR的靈敏度高四個數(shù)量級；反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR Green I觀 察的結(jié)果與擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致。
[0008] 2、將哈爾濱市周邊豬場的47份臨床樣品RT-LAMP檢測結(jié)果與已得到驗證的 RT-PCR和ELISA結(jié)果進行比對，結(jié)果顯示符合率為100%。
[0009] 3、本發(fā)明建立的PRV的RT-LAMP檢測方法具有快速、特異、靈敏、簡單易操作且設(shè) 備要求低等特點，具有實地檢測PRV的前景。
【附圖說明】
[0010] 圖1為PRV RT-LAMP擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M，DL5000 ;1，RT-LAMP產(chǎn) 物；2,陰性對照； 圖2為加入SYBR Green I后紫外燈下觀察結(jié)果，1，RT-LAMP產(chǎn)物；2,陰性對照； 圖3為町-1^1^反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果，]?，015000;1-5，611：，621：，631：，641：和651：;6， 陰性對照； 圖 4 為 RT-LAMP 反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果，M，DL5000 ;1-5,20,30,40,50,60 min ;6,陰性對 昭. 圖5為RT-PCR靈敏性結(jié)果，M，DL2000,1-7,10倍比稀釋濃度分別為895 ng/ii L，89. 5 ng/ ii L，8. 95ng/ ii L，895 pg/ ii L，89. 5 pg/ ii L，8. 95pg/ ii L，895 fg/ ii L ;8,陰性對照； 圖6為RT-LAMP靈敏性結(jié)果，M，DL5000,1-9道，10倍比稀釋濃度分別為895 ng/ ii L， 89. 5 ng/u L,8. 95ng/u L,895 pg/u L,89.5 pg/u L,8. 95pg/u L,895 fg/u L,89. 5fg/ U L ;9,陰性對照； 圖7為PRV RT-LAMP擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，M，DL5000 ;l-6 :PRV、PEDV、 TGEV、PPV、PRRSV、PrV;7,陰性對照； 圖8為加入SYBR Green I后紫外燈下觀察結(jié)果，M，DL5000 ; 1-6 :PRV、PEDV、TGEV、 PPV、PRRSV、PrV;7,陰性對照。
【具體實施方式】
[0011] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護范圍中。
[0012] 本發(fā)明提供了一種豬輪狀病毒RT-LAMP檢測方法，具體內(nèi)容如下： 1材料與方法 1. 1材料 1. 1. 1病毒 豬輪狀病毒（porcine rotavirus, PRV)，豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV),豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)，豬細小病毒（porcine parvovirus, PPV)，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),偽狂犬病毒（pseudorabies virus, PrV)〇
[0013] 1.1.2臨床樣本 2014年11月從哈爾濱市周邊豬場采集47份仔豬腹瀉糞便樣。
[0014] 1. 1. 3主要試劑包被稀釋液 0.01 mol/L PBS、1XPBST、0PD顯色液、2 mol/L H2504、0.5%脫脂乳。Bst DNA聚合 酶購自于NEB公司。SYBR Green I購自于Invitrogen公司。瓊脂糖購自Promega公司。 Easy Taq DNA聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量核酸DL2000 DNA Marker購自博大泰克生物技術(shù)有限 公司。DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL5000購自大連寶生物公司。DMEM細胞培養(yǎng)液購自GIBC0公司。飛 捷RNA提取試劑盒購自南京凱基公司。反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、RNA酶等均購自于 Sigma公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體購自購自武漢博士德公司。
[0015] 1.2引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的PRV毒株DN30209株序列，利用RT-LAMP在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4 (Eiken Chemical, Japan, http://www. primerexplorer. jp/e/)設(shè) 計兩對町-1^1^引物？1?、81?、？3、83以及1對町-?0?引物？1、？2(表1)，以上引物均由 北京華大科技有限公司合成。
[0016] 表1弓丨物序列表
【主權(quán)項】
1. 一種豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法，其特征在于所述檢測方法步驟如 下： (1) 建立RT-LAMP反應(yīng)體系，同時設(shè)立陰性對照；所述RT-LAMP反應(yīng)體系共25iiL，包 括：模板 2iiL，0.8iiMFIP和BIP引物各 0.5iiL，0.2iiM的F3 和B3 引物各 0.25iiL， 2ULdNTP, 5mMMgSO4,8UBstDNApolymerase和IXThermoPolBuffer,IULMLV反 轉(zhuǎn)錄酶，用滅菌水體積補足至25yL;所述陰性對照的模板為滅菌水； (2) 在恒溫水浴鍋中61-65°C反應(yīng)20-60min后，80°C終止20min，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳鑒定或加入2iiLSYBRGreenI染料，紫外燈下或肉眼觀察結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法，其特征在于所 述最佳反應(yīng)條件為62°C40min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬輪狀病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于所述FIP引物序 列如下：GCACAGATTCACAAACTGCAGATATATTTCATGCTACAGTTGGACT。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法，其特征在于所 述BIP引物序列如下：CGCTTCCGAAACTTTAITGGCAATACCTGGTGGGAACACTG。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法，其特征在于所 述F3 引物序列如下：CAAACCTAITTCCGCAAGC。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬輪狀病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于所述B3引物序列 如下：GAATAATTGGTAATCAATTCTGTCC。
7. 權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法在 鑒別檢測豬輪狀病毒（PRV)與豬偽狂犬病毒（PrV)、豬細小病毒（PPV)、豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬輪狀病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴增檢測方法及應(yīng)用。所述檢測方法步驟如下：（1）建立RT-LAMP反應(yīng)體系，同時設(shè)立陰性對照；所述RT-LAMP反應(yīng)體系共25μL，包括：模板2μL，0.8μM FIP和BIP引物各0.5 μL，0.2 μM的F3和B3引物各0.25μL，2μL dNTP，5 mM MgS04，8UBst DNA polymerase和1×ThermoPol Buffer，1μL MLV反轉(zhuǎn)錄酶，用滅菌水體積補足至25 μL；所述陰性對照的模板為滅菌水；（2）在恒溫水浴鍋中61-65℃反應(yīng)20-60 min后，80℃終止20 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定或加入2 μL SYBR Green I染料，紫外燈下或肉眼觀察結(jié)果。本發(fā)明為PRV的臨床診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡單、快速和準(zhǔn)確的分子生物學(xué)診斷方法。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN104694670
【申請?zhí)枴緾N201510122293
【發(fā)明人】李廣興, 高睿澤, 任玉東, 白云云, 黃小丹
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月20日