Toll-樣受體及免疫刺激性寡核苷酸的制作方法
【專利說明】Tol I-樣受體及免疫刺激性寡核苷酸
[0001] 本發(fā)明涉及：雜合toll-樣受體；包含此類toll-樣受體的細胞；免疫刺激性寡脫 氧核苷酸檢測方法，其中，該方法使用此類toll-樣受體；通過使用該方法檢測到的免疫刺 激性寡脫氧核苷酸；此類免疫刺激性寡脫氧核苷酸在醫(yī)藥中的用途；以及包含此類免疫刺 激性寡脫氧核苷酸的疫苗。
[0002] 在過去二十年中，在免疫科學中已發(fā)現(xiàn)，脊椎動物免疫系統(tǒng)擁有檢測微生物感 染和通過受體介導的對特有且保守的病原體特征的識別(所謂的病原體相關分子模式 (PAMPs)與相關的宿主病原體識別受體（PRRs)相互作用)而引發(fā)快速免疫活化作用的機制 (Iwasaki A, Medzhitov R. 2001 和 Medzhitov R.，2009)〇
[0003] 目前清楚的是，這些PAMP中存在某些形式的病原體脫氧核糖核酸（DNA)。在1995 年，有報道稱細菌DNA中非甲基化的CpG基序引發(fā)鼠 B-細胞活化作用（Krieg等人1995)。 該研宄首次在細菌免疫刺激性含非甲基化CpG的DNA的特異性識別與之前公認的CpG抑制 以及哺乳動物DNA中廣泛存在的CpG甲基化之間建立起聯(lián)系。最有效的B細胞刺激性非甲 基化CpG寡脫氧核苷酸（CpG 0DN)顯示出擁有序列元件GACGTT。
[0004] 這一領域中下一個里程碑性的論文是由日本大坂Shizuo Akira的實驗室發(fā)表 的（Hemmi等人2000)。通過在小鼠中的基因克隆以及靶向基因敲除方法，可以毫無疑義地 表明小鼠中對CpG-ODN的細胞應答是由toll-樣受體9 (TLR9)介導的。接下來表明了 CpG-ODN是主要通過NF λ-Β途徑的TLR9信號傳導的激動劑（Medzhitov 2001)。在接下 來的十年中，已有相當多的關于基礎研宄主題以及關于一般性的潛在免疫治療應用的研宄 發(fā)表（例如綜述于 Krieg 2002，2003，2006; Klinman 2004，Vollmer 2005，Wilson 等 人 2006，Kindrachuk 等人 2008，Dorn 和 Kippenberger 2008，Vollmer 和 Krieg 2009， Wilson等人2009)。許多綜述性文章關注于CpG-ODN的抗感染應用（Krieg 2007)，TLR9激 動劑在癌癥治療中的應用（Krieg 2007，Weiner 2009)，TLR9活化作用用于哮喘和過敏 反應的治療（Kline 2007，Kline 和 Krieg 2008，F(xiàn)onseca 和 Kline 2009)以及作為疫苗 佐劑（Klinman 等人 2004，Klinman 2006，Daubenberger 2007，Wagner 2009，Mutwiri 等人 2009，Klinman 等人 2009)。
[0005] 也已描述和討論CpG ODN在獸醫(yī)應用中，特別是在牛、豬、綿羊、犬、雞和魚中作為 免疫刺激性試劑和疫苗佐劑（Babiuk等人2003，Carrington和Secombes 2006，Griebel 等人 2005，Mutwiri 等人 2003，Singh 和 0'Hagan 2003，Werling 和 Jungi 2003)。
[0006] 迄今為止，對于用作人和非人物種的免疫調(diào)節(jié)劑的特異性CpG 0DN' s的設計仍是 非常隨機的。其原因是多方面的；首先，尚無有關用于人TLR' s的免疫調(diào)節(jié)CpG基序與非 人哺乳動物物種TLR's的免疫調(diào)節(jié)CpG基序之間關聯(lián)的任何知識。其次，還沒有可用的具 有信噪比水平低至足以允許選擇性檢測極低濃度CpG 0DN's效果的含哺乳動物TLR的體外 細胞系統(tǒng)。此外，沒有可用的高通量篩選方法，即使存在這樣的高通量篩選方法，也沒有作 為免疫調(diào)節(jié)劑的CpG 0DN' s體內(nèi)相對于體外效力之間的明確關聯(lián)。
[0007] 在本發(fā)明申請日時未公開的、申請?zhí)枮镻CT/EP2011/074211的PCT專利申請中， 發(fā)明人已描述了一種體外細胞系統(tǒng)，其適用于作為用于家禽的免疫調(diào)節(jié)劑的CpG 0DN's的 可重復體外測試和選擇。該系統(tǒng)基于TLR21(雞中TLR9的功能同源物）的克隆和異源表達。
[0008] 為了研發(fā)類似的系統(tǒng)以測試作為用于哺乳動物(用于人物種且用于非人物種如 犬、牛以及豬物種）的免疫調(diào)節(jié)劑的CpG ODN' s，決定應用類似的方法，然而，現(xiàn)在基于尤其 是（i. a.)犬、牛和豬toll-樣受體TLR9的克隆和表達。
[0009] 為此，使用HEK293細胞的克隆系，其基因組中包含有整合型的pNifTy2-SEAP (Invivogen)，其提供基于測量分泌型堿性磷酸酶（SEAP)產(chǎn)生的NF-κ B活化報道基因測 定（參見實施例部分）。本發(fā)明人表明了此類細胞系可廣泛地應用于，以從多種脊椎動物 (牛、犬、豬、雞）物種分離的TLR1/2、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7以及TLR8的穩(wěn)定功 能性表達為目的的實驗中。
[0010] 針對此背景，曾預期牛、犬和豬TLR9的表達應是簡單的，預期進一步被雞 TLR9功能同源物TLR21基于格外運行良好的（exceptionally well-functioning) HEK293-pNifTy2-SEAP的功能性表達所加強。
[0011] 然而，盡管成功地實現(xiàn)質(zhì)粒引入的選擇（G418或潮霉素）這一事實，但用牛、犬 和豬TLR9進行的重復轉染實驗沒有產(chǎn)生能用已知的標準TLR9激動劑，如2006-PT0 (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)或 2007-PT0 (TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT)刺激的細胞系。僅 在少數(shù)實驗中，開始時可見到多克隆轉染子合并物（pool)中的微弱信號。進一步細胞系培 養(yǎng)時這些信號即消失，并且無法通過單細胞克隆來拯救。利用另一種含有NF- κ B活化作用 報道基因的細胞類型，即牛巨噬細胞系B0MAC-pNifTy2-SEAP，進行了類似的實驗。結果與之 前在HEK293-pNifTy2-SEAP中見到的基本上一樣。
[0012] 功能性表達（如通過SEAP信號顯示的）的意外失敗原因仍舊未知。為克服上述 問題，利用293XL/裸細胞（InvivoGen)，表達人抗凋亡Bcl-XL基因的嘗試，也沒有產(chǎn)生足夠 高的SEAP表達水平。
[0013] 因此，仍需要用于選擇具有高免疫調(diào)節(jié)作用從而能以低劑量在哺乳動物中起效的 CpG 0DN' s的具選擇性且靈敏的系統(tǒng)。
[0014] 本發(fā)明的一個目的在于提供此類具選擇性且靈敏的CpG ODN選擇系統(tǒng)。
[0015] 目前令人驚奇地發(fā)現(xiàn)包含家禽TLR21的Toll-白介素 I受體抗性（TIR)結構域 和哺乳動物TLR9的胞外配體結合結構域的雜合toll-樣受體，能夠克服上述的低功能性 表達或無表達的問題。
[0016] TLRs是非常保守的I型跨膜（TM)蛋白，由N-末端信號肽、含富含亮氨酸重復的 胞外配體結合結構域、單一的TM結構域、和主要由Toll-白介素 I受體抗性（TIR)結構 域構成的胞質(zhì)區(qū)所構成。
[0017] 僅作為實例：小鼠 TLR9的胞外結構域跨越a. a. 1-820的區(qū)域，跨膜結構域跨越 a. a. 820-838的區(qū)域，且胞質(zhì)結構域跨越a. a. 838-1032的區(qū)域。TIR結構域跨越a. a. 872-1032 的區(qū)域（Kajita 等人，BBRC 343: 578-584 (2006))。
[0018] TLR9和家禽同源物TLR21的區(qū)室化在一定程度上區(qū)別于TLR1、2、4、5和 6的區(qū)室化，原因在于TLR9和21中稱作"胞外結構域"的部分位于內(nèi)體性溶酶體 (endolysosome)。結果，TLR9/21的TM區(qū)跨內(nèi)體性溶酶體膜，而非細胞的質(zhì)膜。Barton G. M. 和 Kagan, J.C.在 Nature Reviews 9; 535-542 (2009)中對 TLR 的這一方面以及細胞生 物學進行了總體綜述。
[0019] 僅作為哺乳動物TLR'S的實例，SEQ ID NO'S 1、3和5 (核酸序列）以及SEQ ID NO's 2、4和6 (氨基酸序列）中分別給出了牛、豬和犬TLR9的序列。
[0020] 結果是，組合了哺乳動物TLR9的胞外配體結合結構域的CpG ODN特異性和家禽 TLR21 Toll-白介素 I受體抗性（TIR)結構域的信號傳導特性的本發(fā)明的雜合TLR's被 經(jīng)轉染的細胞接受，而沒有不能接受的副作用，同時它們非常適合于特定檢測對哺乳動物 物種具有特異性免疫刺激性的CpG ODN's。
[0021] 用含編碼此類雜合TLR's的DNA的質(zhì)粒轉染如HEK293細胞或MDCK細胞，得 到穩(wěn)定的雜合TLR's表達，其繼而，在用已知在哺乳動物中有活性的外源CpG ODN's (如 2006-0DN和2007-0DN)刺激時，導致顯著的NF- κ B活化作用。
[0022] 因此，本發(fā)明的第一個實施方案涉及雜合toll-樣受體，其特征在于，所述雜合 toll-樣受體包含家禽TLR21的Toll-白介素 I受體抗性（TIR)結構域和哺乳動物TLR9 的胞外配體結合結構域。
[0023] 跨膜區(qū)（TM區(qū)）和胞質(zhì)結構域的非TIR相關部分的來源不是至關重要的，從這個 意義上講，這些可以獨立地來源于TLR 9或TLR21。
[0024] 在這一實施方案的優(yōu)選形式中，哺乳動物TLR9的胞外配體結合結構域是人、牛、 豬或犬來源的。
[0025] 其中哺乳動物TLR9的胞外配體結合結構域為牛、豬或犬起源的本發(fā)明的雜合 TLR's的實例分別在SEQ ID NO's 8、10和12 (核酸序列）和SEQ ID NO's 9、11和13 (氨 基酸序列）中給出。
[0026] "免疫刺激性非甲基化寡脫氧核苷酸"指包含非甲基化的胞苷-磷酸-鳥苷二核苷 酸序列的寡脫氧核苷酸，其刺激起始信號級聯(lián)放大以導致轉錄因子如NF-κ B或干擾素調(diào) 節(jié)因子3 (IRF3)的活化作用。正是這一活化作用進而導致炎性細胞因子的表達，以及其他 細胞活化事件。NF- κ B結合位點和受NF- κ B影響的基因表達尤其由Schindler和Baichwal (1994)所描述。
[0027] 術語寡脫氧核苷酸指脫氧核苷酸的短核酸聚合物；即包含與磷酸基團和可替換的 有機堿連接的多個脫氧核糖的分子。此類有機堿是取代型嘧啶和取代型嘌呤。作為實例分 別有胞嘧啶和胸腺嘧啶，腺嘌呤和鳥嘌呤。
[0028] 本發(fā)明的寡核苷酸可以包含修飾。此類修飾的實例為例如在位于核苷的3'和/ 或5'末端的核苷間磷酸二醋橋（phosphodiester internucleoside bridge)中的修飾。此 類修飾尤其涉及例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯對磷酸二酯的替代。
[0029] 基本上，根據(jù)合成方法，一般兩核苷酸之間的鍵的常見類型是：磷酸二酯（PDE)鍵 和硫代磷酸酯（PTO)鍵。為了改進CpG 0DN's的穩(wěn)定性和免疫刺激性作用，合成的寡脫氧 核苷酸的結構單元可以提供有硫代磷酸酯，使得它們形成PTO鍵。
[0030] 其他修飾為例如以脫磷酸橋（dephospho bridge)替代磷酸二醋橋。脫磷酸橋的 實例有甲基輕胺、formacetal和二亞甲基諷（dimethylenesulfone)基團。
[0031] 仍其他的修飾為涉及由非天然核苷堿基替代天然核苷堿基的修飾，所述非天然核 苷堿基如5-氟胞嘧啶、7-脫氮雜-7-取代的鳥嘌呤、7-脫氮雜-8-取代的鳥嘌呤、2-硫尿 嘧啶、二氫尿嘧啶、5-溴-胞嘧啶、6-取代的胞嘧啶或M-取代的胞嘧啶。
[0032] 再其他的修飾是涉及糖單元替代的修飾；由經(jīng)修飾的糖單元例如L-2' -脫氧核糖 或2' -L-阿拉伯糖替代β-核糖（ribose sugar)或fi-D-2' -核糖單元。
[0033] 對寡核苷酸給出進一步介紹的教科書為例如"PCR Primer: A Laboratory Manual"，第