一種精確定量控制肝素/類肝素中硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種精確定量控制肝素/類肝素中硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1. 1 肝素
[0003] 1. 1. 1肝素簡(jiǎn)介：
[0004] 肝素化巧arin，H巧首先從肝臟發(fā)現(xiàn)而得名，肝素廣泛分布在哺乳動(dòng)物的組織 中，如肝、肺、腸系膜、屯、、脾、腎、胸腺、胎盤(pán)、肌肉和血液中都有存在（高照明，曹現(xiàn)平，張 玉冰，豬小腸粘膜/漿膜/腸衣中的粘多糖組成分析[J]，化學(xué)與生物工程，2012, 29(4); 91-94)。各種組織中肝素的含量與肥大細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)，肥大細(xì)胞內(nèi)的顆粒含有肝素或肝 素前體，當(dāng)物理或化學(xué)剌激使肥大細(xì)胞脫粒時(shí)，肝素被釋放出來(lái)，在體內(nèi)被肝臟產(chǎn)生的肝素 酶滅活而從尿排泄出來(lái)炬rinkous K.M, Smith H.P, Warner E.D,et al. The Inhibit ion o f Blood Clotting:an Unidentified Sub-stance which Acts in Conjunction w it h Heparin to Prevent t he Conversion of Prothrombin into ThrombinlJ2. Am. J. Phy siol，1939, 125:683~687.)。肝素具有強(qiáng)抗凝作用，是防治深層靜脈血栓形成等血栓栓塞 性疾病的首選藥物。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素不但有抗凝、抗血栓形成和調(diào)整血脂的 作用，還有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能煙larles H Best. Pr巧aration of Heparin and Its Use in the First Clinical Cases[J]. Circulation. 1959, 19:79~ 86)。肝素在體內(nèi)多W與蛋白質(zhì)結(jié)合W糖蛋白復(fù)合物的形式存在。該種復(fù)合物沒(méi)有抗凝血活 性，但在去除蛋白質(zhì)后，該種抗凝活性逐漸表現(xiàn)出來(lái)OJader皿,Lopes C, Rocha Hao, Santos EA, Dietrich CP. Heparins and heparinoids occurrence, structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activitie[J]. Curr. pHarm. Des. 2004,10 ;951 ~966)。 由于瘋牛病的病原體阮粒是傳染性蛋白質(zhì)顆粒，為不含有核酸的感染性蛋白因子，其主要 成份是一種蛋白酶抗性蛋白，具有對(duì)蛋白酶的抵抗力，易溶于去污劑、有致病力和不誘發(fā)抗 體等特性，給患病動(dòng)物及人類的診斷和防治帶來(lái)很大麻煩，給人類和動(dòng)物的健康和生命帶 來(lái)嚴(yán)重的威脅，因此從反當(dāng)動(dòng)物中提取肝素鋼存在較大的安全性風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)在藥用肝素鋼主 要從豬小腸黏膜提取化azuy址i Sug址ara, Satoml P'Jadanaka, Kyoko Takeda. Structural analysis of unsaturated hexasaccharides from shark cartilage chondroitin sulfate D that are substrates for the exolytic action of chondroitin sulfate ABC lyase. Elurope of journal biochemistry, 2006, 239:871-880)。
[0005] 肝素鋼的結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，是由糖醒酸和葡萄糖胺W 1 - 4鍵連接起來(lái)的為主 要重復(fù)二糖單位組成的多糖鏈的混合物。其分子量是一個(gè)很寬的分布為3000-30000， 平均分子量是12000-15000,含10-30個(gè)二糖單位不等，約有4種糖醒酸和10種葡萄糖 胺交替無(wú)序排列組成（Rafael B. Erlich, Claudio C.Werneck, Paulo A.S.Mourao,et al.Major glycosaminoglycan species in the developing retina:synthesis tissue distribution and effects upon cell death.Expetimental eye research, 2003, 77:157-165)。肝素鋼結(jié)構(gòu)中的主要單糖是2-0-硫酸-a -L艾杜糖醒酸 及6-0-硫酸-N-硫酸-a -D葡萄糖胺，該兩種糖單元是肝素鋼結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)頻率最高的 兩個(gè)重復(fù)單元，由它們組成的=硫酸二糖的重復(fù)單位構(gòu)成了肝素所謂的"規(guī)則區(qū)"，是肝 素結(jié)構(gòu)的主要部分，也起到了肝素鋼抗凝血的主要作用（Komazawa H，Saiki I，Igarashi Y, et al.The conjugation of RGDS p巧tide with CM-chitin(4):299-307.)。另外 的含有多種單糖殘基，如a A-艾杜糖醒酸，葡萄糖醒酸，6-0-硫酸-N-己酷- a -D葡 萄糖胺，0 -D-葡萄糖醒酸及3-6-雙-0-硫酸-N-硫酸- a -D葡萄糖胺則W很低的頻 率出現(xiàn)于"非規(guī)則區(qū)"化irano S, Tanaka Y, Haseqawa M, et al.Effect of sulfated deriva tives of chitosan on some blood coagulant factors[J]. Carbohydr Res, 1985, 137 (3) : 205-215.)。一定數(shù)目的6位無(wú)硫酸化的葡萄糖胺及2-0-硫酸-a -D葡 萄糖醒酸的存在使得肝素中出現(xiàn)了 10種不同的單糖（4種糖醒酸和6種葡萄糖胺），從而使 得肝素的整個(gè)結(jié)構(gòu)變得異常復(fù)雜（高寧國(guó)，.肝素結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展[J]，生物工程進(jìn) 展，1999, 19,（5) ;4-13)。肝素常與其他粘多糖一起被提取出來(lái)，可由己糖醒酸a-艾杜糖 醒酸、葡萄糖醒酸）與硫酸氨基葡萄糖分子W-定的比例交替聯(lián)結(jié)形成具有六糖或八糖單 位的線型鏈狀大分子，其結(jié)構(gòu)單元如下所示（A化ertini R, et al.Qion化oitin-4-Sulfate Protects High Density Lipoprotein against Copper Dependent Oxidation[J]. Archives of Biochemistry and BiopHysis, 1999. 365(1):143-149)；
[0006]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種定量控制類肝素或肝素樣品中硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的方法，分為下述 A和B兩種方法： 方法A包括下述步驟： 1) 向含類肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的類肝素樣品的溶液中或含肝素、硫酸軟骨 素和硫酸皮膚素的肝素樣品的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶B活性的蛋白質(zhì)，使其與類肝 素或肝素樣品中的硫酸皮膚素進(jìn)行酶解反應(yīng)，監(jiān)測(cè)酶解過(guò)程溶液中硫酸皮膚素的含量變 化，待硫酸皮膚素的含量達(dá)到預(yù)期含量時(shí)，終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應(yīng)； 2) 向終止硫酸軟骨素酶B催化的酶解反應(yīng)的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶AC活性的 蛋白質(zhì)，使其與溶液中的硫酸軟骨素進(jìn)行酶解反應(yīng)；監(jiān)測(cè)酶解過(guò)程溶液中硫酸軟骨素的含 量變化，待硫酸軟骨素的含量達(dá)到預(yù)期含量時(shí)，終止硫酸軟骨素酶AC催化的酶解反應(yīng)，得 到期望的硫酸軟骨素及硫酸皮膚素含量的類肝素或肝素樣品溶液； 方法B包括下述步驟： a) 向含類肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的類肝素樣品的溶液中或含肝素、硫酸軟骨 素和硫酸皮膚素的肝素樣品的溶液中加入具有硫酸軟骨素酶AC活性的蛋白質(zhì)，使其與類 肝素或肝素樣品中的硫酸軟骨素進(jìn)行酶解反應(yīng)；監(jiān)測(cè)酶解過(guò)程溶液中硫酸軟骨素的含量變 化，待硫酸軟骨素的含量達(dá)到