一種豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株及其制備的預(yù)防豬胸膜肺炎產(chǎn)品的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物和免疫學領(lǐng)域，特別是一種豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株及其 制備的預(yù)防豬胸膜肺炎產(chǎn)品
【背景技術(shù)】
[0002] 豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一種豬的呼吸道疾病，本病主要臨床特征表現(xiàn)為出血性和 壞死性肺炎、纖維素性胸膜炎。通常認為，本菌通過呼吸道進入豬體內(nèi)，然后直接通過氣管 和支氣管進入肺泡。除宿主和環(huán)境因素外，各種毒力因子是本菌致病性的主要因素，它們包 括莢膜、內(nèi)毒素、外毒素、粘附素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、外膜蛋白和分泌的酶類。
[0003] 胸膜肺炎放線桿菌是引起豬傳染性胸膜肺炎的主要病原，它是一種革蘭氏陰性短 桿菌，具有莢膜和菌毛，無運動性，不能形成芽孢。截止目前，根據(jù)APP表面可溶性抗原（主 要為莢膜多糖和脂多糖）的差異性，通過血清學方法將APP分為15個血清型，不同血清型 菌株毒力存在顯著的差異。
[0004] APP毒力因子主要包括Apx毒素、尿素酶、外膜蛋白、莢膜和脂多糖等。研宄證實， Apx毒素既是APP最重要的毒力因子之一，同時又是主要的免疫原性蛋白，在APP免疫保護 方面發(fā)揮重要作用，根據(jù)溶血性和細胞毒性的差異將Apx毒素分成四種類型，分別為ΑρχΙ、 ApxII、ApxIII和ApxIVA，每種毒素的基因組成及生物學活性存在明顯差異。研宄還顯示， APP所有血清型菌株均可產(chǎn)生尿素酶，其活性有助于APP在豬呼吸道定殖感染，對APP的持 續(xù)性感染也有重要作用，UreC是尿素酶的C蛋白，研宄證實該蛋白在APP尿素酶活性中發(fā) 揮重要作用，該基因失活后脲酶活性消失，APP毒力下降了四倍。
[0005] 鑒于豬傳染性胸膜肺炎在世界各地廣泛流行和傳播并造成較大的經(jīng)濟損失，采取 積極防制措施控制該病極為必要。雖然加強飼養(yǎng)管理和抗生素藥物防治對控制該病具有重 要作用，但疫苗預(yù)防仍是控制該病的關(guān)鍵措施。目前APP全菌滅活疫苗是應(yīng)用最廣泛、最成 熟的一種防治豬傳染性胸膜肺炎的疫苗，但該疫苗缺乏交叉保護活性，對不同血清型菌株 不能發(fā)揮保護作用。滅活疫苗和亞單位疫苗雖然可以降低患病豬的死亡率，但動物仍會出 現(xiàn)亞臨床癥狀并進一步發(fā)展為慢性感染。而研宄發(fā)現(xiàn)野外感染任何一種血清型的康復(fù)豬可 抵抗不同血清型菌株的再次感染，因而提示應(yīng)用APP活疫苗可提供較強的交叉免疫保護。 目前APP減毒活疫苗的研制仍處于實驗室研制階段，商品化的減毒活疫苗尚未出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 根據(jù)上述領(lǐng)域的不足和需求，本發(fā)明提供一種豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株。本 發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：
[0007] 一種豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)減毒菌株 GS7CA，其保藏號為，CGMCC NO. 10016。
[0008] 所述豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株在制備預(yù)防豬胸膜肺炎的產(chǎn)品中的用途。
[0009] -種預(yù)防豬胸膜肺炎的疫苗，其活性成分包含所述豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌 株。
[0010] 一種預(yù)防豬胸膜肺炎的疫苗，其活性成分為所述豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株。
[0011] 所述疫苗還包括用于制備疫苗的常規(guī)輔助成分。
[0012] 一種經(jīng)鼻腔接種的預(yù)防豬胸膜肺炎的活疫苗，是所述豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌 株的單菌落接種于TSB+NAD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~16h后，按培養(yǎng)物：TSB+NAD培養(yǎng)液為1 : 50 比例接種于TSB+NAD培養(yǎng)液中培養(yǎng)至0D600達到0. 8的產(chǎn)物。
[0013] 一種預(yù)防豬胸膜肺炎的方法，其特征在于，使用以所述豬胸膜肺炎放線桿菌減毒 菌株為活性成分的產(chǎn)品對豬進行免疫。
[0014] 胸膜肺炎放線桿菌（APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎的呼吸道病原細菌，其中Apx 毒素和尿素酶（Urease)均是其主要的毒力因子，且Apx毒素又是其主要的免疫原性蛋白。 為構(gòu)建APP減毒突變菌株，本發(fā)明首先利用僅表達ApxII毒素蛋白且毒力較弱的APP血清 7型參考菌株（WF83)作為母源菌株，缺失apxIIC基因片段并插入具有免疫原性的apxIA-N 基因片段，利用sacB基因負向篩選系統(tǒng)構(gòu)建無抗生素抗性基因標記的apXIIC7apxIA+單 突變菌株（GS7C);在單突變菌株GS7C的基礎(chǔ)上進一步缺失基因組中ureC基因片段，并插 入具有免疫原性的apxIII-N基因片段，進而再利用sacB基因負向篩選系統(tǒng)構(gòu)建成功表達 ApxIII-N蛋白的apxIIC7apxIA+、ureC7apxIIΓ雙突變菌株（GS7CA)。該雙突變菌株生物 學特性鑒定結(jié)果顯示，雙基因突變不影響細菌增殖能力，溶血活性和尿素酶活性完全喪失， 可表達ApxII蛋白及插入的外源基因 ApxIlI-N蛋白，連續(xù)傳代基因組中插入的外源基因可 穩(wěn)定遺傳，對試驗小鼠腹腔攻毒結(jié)果顯示雙突變菌株毒力較母源菌株降低9. 2倍，對斷奶 仔豬攻毒試驗顯示雙突變菌株對仔豬肺臟的損傷較母源菌株顯著降低，對斷奶仔豬的免疫 攻毒保護試驗顯示雙突變菌株對APP不同血清型菌株的攻毒具有一定的交叉保護能力。
[0015] 本發(fā)明還提供一種預(yù)防豬胸膜肺炎的疫苗，所述疫苗的活性成分為上述豬胸膜肺 炎放線桿菌減毒菌株。本發(fā)明提供的疫苗具有下述優(yōu)點：（1)具有交叉保護活性：本發(fā)明的 疫苗屬于減毒活疫苗，對APP不同血清型菌株具有一定的交叉保護能力；（2)毒力低：所述 疫苗的活性成分豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株，其毒力較母源菌株降低9. 2倍，對豬進行 免疫后不會引起發(fā)病或死亡，安全性高；(3)質(zhì)量穩(wěn)定：生產(chǎn)疫苗所使用的豬胸膜肺炎放線 桿菌減毒菌株，其具有免疫原性的外源基因 ApxIII-N可穩(wěn)定遺傳，能夠保證每批疫苗的質(zhì) 量；(4)生物安全性高：所述疫苗的活性成分豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株，采用無抗性標 記基因 sacB基因負向篩選系統(tǒng)篩選而得，無生物安全風險，可用于疫苗的大量生產(chǎn)。
[0016] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述疫苗的活性成分除了本發(fā)明的豬胸膜肺炎放線桿 菌減毒菌株外，還可以包含其它的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的具有豬胸膜肺炎免疫原性的成 分，與本發(fā)明的豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株一起發(fā)揮免疫作用，增強健康豬對APP不同 血清型菌株的抵抗能力。
[0017] 本發(fā)明還特別請求保護上述菌株制成的一種經(jīng)鼻腔接種活疫苗，是所述豬胸膜 肺炎放線桿菌減毒菌株的單菌落接種于TSB+NAD培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~16h后，按培養(yǎng)物： TSB+NAD培養(yǎng)液為1 : 50比例接種于TSB+NAD培養(yǎng)液中培養(yǎng)至0D600達到0. 8的產(chǎn)物。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株，溶血活性和尿素酶活性 完全喪失，毒力大大降低，可穩(wěn)定遺傳。采用本發(fā)明的豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株制成的 減毒活疫苗，毒力低，具有交叉保護活性，生物安全性高，質(zhì)量穩(wěn)定。
[0019] 本發(fā)明提供的豬胸膜肺炎放線桿菌減毒菌株，已進行專利保藏，保藏信息如下：
[0020] 生物保藏信息：
[0021] 生物材料名稱：GS7CA
[0022] 分類命名：胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae)
[0023] 保藏日期：2014年11月20日
[0024] 保藏號：CGMCC No. 10016.
[0025] 保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
【附圖說明】
[0026] 圖1.經(jīng)兩次單交換構(gòu)建突變菌株GS7C的PCR鑒定結(jié)果，其中M為Ikb plus Marker ;A : 1-10,第1次單交換突變菌株；B : 1-2, GS7C，3, APP7,4,第1次單交換突變菌株。
[0027] 圖2.經(jīng)兩次單交換構(gòu)建突變菌株GS7CA的PCR鑒定結(jié)果，其中M為Ikb plus Marker ;A :1-7,第1次單交換突變菌株；B :1，GS7CA，2, GS7C，C，陰性對照，P，陽性對照。
[0028] 圖3.母源菌株和突變菌株在培養(yǎng)基中增殖能力的比較。
[0029] 圖4.母源菌株與突變菌株溶血活性的比較，其中，中間垂直線為表皮葡萄球菌生 長線，生長線兩側(cè)為APP菌落。
[0030] 圖5.細菌尿素酶活性檢測結(jié)果。
[0031] 圖6.母源菌株與突變菌株表達ApxII蛋白（A)和ApxIII蛋白⑶的Western blot檢測。
[0032] 圖7.突變菌株遺傳穩(wěn)定性的PCR檢測結(jié)果，其中，M為Ikb plus Marker ;A :1_9， GS7C不同代次采樣的檢測結(jié)果，10, APP7 ;B :1-10, GS7CA不同代次采樣的檢測結(jié)果，11， APP7〇
【具體實施方式】
[0033] 以下通過具體實施例對本發(fā)明進行解釋，需要理解的是，下述實施例僅作為對本 發(fā)明的進一步說明，本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0034] 實驗材料和試劑：
[0035] (1)菌株和質(zhì)粒
[0036] APP血清1型參考菌株（4074)、血清2型參考菌株（S1536)、血清3型參考菌株 (S1421)和血清7型參考菌株（WF83)，由澳大利亞Pat Blackall博士惠贈，屬于已知菌株， 記載在（I)Nielsen. R. · 1990. New diagnostic techniques:A review of the HAP group of bacteria. Can. J. Vet. Res. ,54:68-71·和（2)Blackall PJ，Klaasen HL，Bosc