一種具有增強(qiáng)的抑菌效果的噬菌體裂解酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種通過(guò)定點(diǎn)突變制備具有增強(qiáng)的抑 菌效果的噬菌體裂解酶的方法及得到的突變的噬菌體裂解酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著耐藥性的不斷出現(xiàn)，噬菌體已經(jīng)成為研宄者開(kāi)發(fā)新型生物制劑的熱點(diǎn)之一。 但噬菌體本身不能離開(kāi)宿主菌生存、可能帶來(lái)抗性基因、可能引起的毒力傳播，使得人們對(duì) 是否應(yīng)開(kāi)發(fā)噬菌體制劑來(lái)預(yù)防和治療細(xì)菌感染這一問(wèn)題仍然存在爭(zhēng)議。因此，人們迫切需 要尋找一種更安全有效的預(yù)防治療細(xì)菌感染的方法。噬菌體裂解酶作為一種新型生物抗菌 制劑所表現(xiàn)出的諸多優(yōu)點(diǎn)也受到了研宄者的青睞。菌體裂解酶（bacteriophage Iysins) 是由雙鏈DNA噬菌體在溶菌周期末期在宿主菌體內(nèi)產(chǎn)生的酶，除單鏈DNA的絲狀噬菌體外， 大多數(shù)噬菌體依靠裂解酶水解宿主菌細(xì)胞壁中的肽聚糖從而釋放子代噬菌體。
[0003] 純化的噬菌體裂解酶可作用于細(xì)菌細(xì)胞壁特有的肽聚糖，同時(shí)引起細(xì)菌細(xì)胞裂 解。但由于細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異，裂解酶對(duì)G+及0-菌的菌外殺傷效果不同，對(duì)G +細(xì)菌的 作用明顯高于對(duì)菌的作用。盡管如此，噬菌體裂解酶獨(dú)特的殺菌特點(diǎn)和作用優(yōu)勢(shì)仍受到 了研宄者的青睞，并且通過(guò)基因工程手段對(duì)噬菌體裂解酶進(jìn)行技術(shù)改造獲得寬宿主譜的新 型裂解酶蛋白也已經(jīng)成為可能。
[0004] 高效性并在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮效力殺死細(xì)菌是噬菌體裂解酶顯著的殺菌特點(diǎn)。幾種裂 解酶混合或裂解酶與抗生素聯(lián)合使用時(shí)也能產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，提高殺菌效果。同時(shí)，相 對(duì)較高的殺菌特異性而幾乎不影響正常菌群是噬菌體裂解酶的又一大優(yōu)勢(shì)。一般來(lái)說(shuō)，葡 萄球菌噬菌裂解酶只殺滅特定的葡萄球菌，肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶只對(duì)特定的鏈球菌敏 感，它們對(duì)機(jī)體正常菌群幾乎不會(huì)影響。當(dāng)然，也有部分噬菌體裂解酶也表現(xiàn)出了一定的廣 譜性。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)外很多研宄者對(duì)多種噬菌體裂解酶做了不同程度的研宄。Schuch等首次 報(bào)道了噬菌體裂解酶在治療細(xì)菌感染方面的應(yīng)用。Vasala等將乳酸桿菌噬菌體LL-H中的 一段裂解酶基因克隆到大腸桿菌中，表達(dá)出了具有溶解細(xì)胞壁作用的酶。Kikkawa等研宄炭 疽桿菌裂解酶PlyG經(jīng)表達(dá)和純化后，利用ELISA定性和定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，裂解酶PlyG具有裂 解B類炭疽桿菌的作用，但裂解譜比較狹窄。Djurkovic等利用鏈球菌裂解酶Cpl-I和抗生 素共同作用于耐青霉素的鏈球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)裂解酶與青霉素發(fā)揮出了協(xié)同作用。我國(guó)近幾 年也有人開(kāi)始利用噬菌體裂解酶等基因進(jìn)行克隆并表達(dá)。陸海榮等將肺炎鏈球菌噬菌體裂 解酶CPL21基因插入pET28a載體，在大腸桿菌BL21中獲得高效可溶性表達(dá)，經(jīng)過(guò)DEAE親 和層析，獲得了純度高達(dá)97%的蛋白，抑菌試驗(yàn)表明，純化的CPL21蛋白對(duì)臨床肺炎鏈球菌 具有明顯的殺菌作用，且抑菌圈大小跟蛋白濃度成正比關(guān)系。劉爽等將噬菌體PhiX174裂 解酶E克隆到pBV220載體后，再將重組載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌O 157 : H 7中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后， 發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157 : H7細(xì)菌表面形成了許多小孔，菌體內(nèi)容物由孔道流出，形成菌殼，對(duì)大 腸桿菌的裂解效率達(dá)98. 4%，這一試驗(yàn)也為菌影疫苗的制備提供了思路。楊文慧等將分枝 桿菌菌體D29裂解酶基因 genelO在大腸-分枝桿菌穿梭載體克隆后，經(jīng)分枝桿菌誘導(dǎo)表 達(dá)，并證實(shí)了 genelO蛋白具有裂解活性。
[0006] 雖然噬菌體裂解酶和抗生素及噬菌體治療相比存在諸多優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些問(wèn) 題，其中抗菌藥物的安全性是人們特別關(guān)注的問(wèn)題。由于噬菌體裂解酶殺菌高效迅速的特 點(diǎn)，人們也擔(dān)心裂解酶再破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜時(shí)細(xì)菌裂解產(chǎn)生的有毒物質(zhì)、炎性物質(zhì) 等能否對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，但目前并沒(méi)有關(guān)于裂解酶對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害的報(bào)道。在體內(nèi)的清除 速率是影響裂解酶殺菌作用的另一方面，由于噬菌體裂解酶是蛋白質(zhì)，將其應(yīng)用于黏膜或 全身時(shí)，會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而降低其活性，并加快其體內(nèi)清除速率。另外，在體內(nèi) 裂解酶還可能被水解酶降解而失活，這也加快了其在體內(nèi)清除的速度，成為裂解酶廣泛應(yīng) 用于臨床前需要解決的問(wèn)題。
[0007] 隨著人類進(jìn)入后基因組時(shí)代，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步同時(shí)也 推動(dòng)了裂解酶改造領(lǐng)域的發(fā)展。一些研宄者通過(guò)替換裂解酶的結(jié)構(gòu)域的方法改變了天然裂 解酶的特異性和催化活性。通過(guò)對(duì)裂解酶的有益修飾和改造，不僅可以增加裂解酶的裂解 活性，還可能擴(kuò)展其裂解譜進(jìn)而達(dá)到優(yōu)化裂解酶的目的。
[0008] 近年來(lái)隨著研宄者對(duì)噬菌體及其裂解酶研宄的重視，越來(lái)越多的噬菌體裂解酶已 經(jīng)通過(guò)原核表達(dá)等方法制備純化，并且應(yīng)用于細(xì)菌感染等方面的治療?；谑删w裂解酶 具有裂解效率高，不易產(chǎn)生耐藥菌株等優(yōu)點(diǎn)，為研宄者開(kāi)發(fā)新型藥物特別是能殺滅抗生素 耐藥菌的生物制劑提供了廣闊的發(fā)展前景。用其高性能的裂解酶更具理論和實(shí)用價(jià)值。目 前，對(duì)噬菌體裂解酶研宄正朝著以下幾個(gè)方向發(fā)展：探宄重要致病菌噬菌體及其裂解酶的 基因序列及生物進(jìn)化關(guān)系；用分子生物學(xué)及微生物培養(yǎng)法獲得大量純化的噬菌體裂解酶并 檢測(cè)其抑菌活性；通過(guò)基因工程等方法對(duì)天然裂解酶進(jìn)行定向有益突變，最大限度的開(kāi)發(fā) 裂解酶的殺菌潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 由于目前越來(lái)越多的耐藥菌的出現(xiàn)，使得噬菌體與裂解酶療法再度進(jìn)入研宄者的 視野。隨著人工改造噬菌體的理論和技術(shù)趨向成熟，應(yīng)用基因工程技術(shù)人工改造噬菌體及 其裂解酶也受到了研宄者的青睞，噬菌體和裂解酶治療也取得了突破性的進(jìn)展。
[0010] 本發(fā)明將裂解酶Bp7e(SEQ ID No :1)氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分 別進(jìn)行突變?yōu)楸彼岷凸劝彼幔?jīng)原核表達(dá)技術(shù)得到了突變體蛋白并經(jīng)Western-blot對(duì) 其進(jìn)行了鑒定，命名為Bp7e突變體蛋白（SEQ ID N〇:2)。對(duì)Bp7e和Bp7e突變體蛋白進(jìn)行 了純化及濃度測(cè)定，通過(guò)體外裂解實(shí)驗(yàn)及裂解譜檢測(cè)得知，純化的Bp7e和Bp7e突變體兩種 蛋白具有廣譜的抑菌作用，對(duì)溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和多種血清型大腸桿 菌均有裂解效果，且Bp7e突變體裂解效果整體優(yōu)于天然裂解酶Bp7e。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1重組噬菌體裂解酶Bp7e突變體的SDS-PAGE電泳分析：1、空質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)； 2、含裂解酶Bp7e突變體的重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá);M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量。
[0012] 圖2誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物（裂解酶Bp7e突變體）的Western-blot鑒定：1、誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn) 物；M、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量。
[0013] 圖3裂解酶Bp7e及其突變體對(duì)溶壁微球菌的抑菌效果：左圖為裂解酶Bp7e ;右圖 為裂解酶Bp7e突變體。
[0014] 圖4裂解酶Bp7e及其突變體對(duì)大腸桿菌的抑菌效果：左圖為裂解酶Bp7c ;右圖為 裂解酶Bp7e突變體。
[0015] 圖5裂解酶Bp7e及其突變體對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果：左圖為裂解酶Bp7e ; 右圖為裂解酶Bp7e突變體。
[0016] 圖6裂解酶Bp7e及其突變體對(duì)沙門氏菌的抑菌效果：左圖為裂解酶Bp7e ;右圖為 裂解酶Bp7e突變體。
[0017] 圖7蛋清溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的抑菌效果。
[0018] 圖8蛋清溶菌酶對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果：自左至右 依次為大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌。
[0019] 圖9裂解酶Bp7e及其突變體對(duì)不同菌株的裂解效率：(A)裂解酶Bp7e的裂解效 率：(B)裂解酶Bp7e突變體的裂解效率。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1 :噬菌體裂解酶Bp7e突變體的原核表達(dá)
[0021] 1.1 材料
[0022] 噬菌體裂解酶Bp7e蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET28a_Bp7e、大腸桿菌BL21菌株由青島農(nóng)業(yè)大 學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；
[0023] 1. 2 方法
[0024] 1. 2. 1噬菌體裂解酶Bp7e氨基酸的首輪突變反應(yīng)
[0025] I. 2. I. 1針對(duì)目的基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物
[0026] 對(duì)Bp7e (SEQ ID No :1)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其第99位亮氨酸突變?yōu)楸彼幔?第102位蛋氨酸突變?yōu)楣劝彼帷８鶕?jù)定點(diǎn)突變?cè)噭┖械囊镌O(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物 由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0027] 引物一上游：5' AAGTTCGTCGTTGTGCTGCAATTAACATGGTCTTC3'
[0028] 引物一下游：5，GAAGACCATGTTAATTGCAGCACAACGACGAACTT3，
[0029] 引物二上游 5' TGTGCTGCAATTAACGAGGTCTTCCAAATGGG3'
[0030] 引物二下游 5 ' CCCAITTGGAAGACCTCGTTAATTGCAGCACA3 '
[0031] 以重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a_Bp7e為模板，用引物一及試劑盒所帶試劑建立50 μ L的 反應(yīng)體系：
[0032] IO