防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌株及其芽孢桿菌菌劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物領(lǐng)域，具體涉及一種防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌株及其 芽孢桿菌菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆疫霉侵染大豆植株引起的大豆根腐病對于大豆生產(chǎn)是一種毀滅性的的病害， 此病害最早于1948年在美國發(fā)現(xiàn)，后不斷蔓延到亞、非、歐、美洲近二十個(gè)國家的大豆產(chǎn) 區(qū)，每年帶來的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)幾十億美元，是大豆生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。80年代 末，該病害首次在我國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)，已成為東北地區(qū)大豆生產(chǎn)上的頭號病害，造成了巨大 的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 大豆疫霉病菌可以在大豆的各個(gè)生育期對大豆造成危害。在大豆出苗前可以引起 種子腐爛、出苗前腐爛，出苗后可以引起植株枯萎。一般苗期感病植株表現(xiàn)為出苗差、近地 表莖部出現(xiàn)水浸狀病斑、葉片變黃萎蔫，嚴(yán)重進(jìn)植猝倒死亡。成株期植株受侵染后下部葉 片變黃，隨后上部葉片逐漸變黃并很快萎蔫；近地表莖部病斑褐色，并可向上擴(kuò)展，莖皮層 及髓變褐；根腐爛，根系發(fā)育不良；未死亡病株的結(jié)莢數(shù)明顯減少，空莢、癟莢較多，籽粒皺 縮。由于在潮濕條件下，根部侵染的病菌可以產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子，孢子隨雨水飛濺，危害莖 部和葉片，甚至出現(xiàn)病莢，其癥狀為綠色豆莢基部出現(xiàn)水浸狀斑，病斑逐漸變褐并從莢柄蔓 延至莢尖，最后整個(gè)豆莢呈黃褐色干枯，種子失水干癟。
[0004] 目前大豆疫病主要是通過化學(xué)防治。雖然化學(xué)防治效果顯著，但由于其作用位點(diǎn) 單一，長期使用使大豆疫霉產(chǎn)生的抗藥性問題日益突出。比如最常用的藥劑甲霜靈（商品 名稱Ridomil)的生物活性強(qiáng)，有持久的殺菌效果。但甲霜靈對大豆疫霉的作用位點(diǎn)單一， 在此作用位點(diǎn)發(fā)生的大豆疫霉的突變會(huì)都有可能對藥劑產(chǎn)生抗性。此外化學(xué)防治的選擇性 差，破壞農(nóng)作物的生態(tài)環(huán)境，不易降解，對人畜極不安全。這些因素使得化學(xué)防治的試劑使 用范圍受到的限制。因此，開發(fā)非化學(xué)防治的措施目前已成為大豆疫霉治理的重點(diǎn)，而用芽 孢桿菌菌劑來進(jìn)行生物防治是其中最有前途的方法。
[0005] 目前，缺乏一種不易使大豆疫霉產(chǎn)生抗性、不污染環(huán)境的防治大豆根腐病的芽孢 桿菌菌株及其芽孢桿菌菌劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種不易使疫霉產(chǎn)生抗性、不污染環(huán)境的防 治大豆根腐病的芽孢桿菌菌株及其芽孢桿菌菌劑。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種防治大豆根腐病的芽孢 桿菌菌株，該菌株為芽孢桿菌（BaciLLus. sp);保藏名稱為芽孢桿菌JSCX-I ;保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號；保藏日期：2015年01月07日；保藏編號：CGMCC No. 10284。
[0008] 進(jìn)一步地，所述芽孢桿菌菌株的單菌落為圓形，乳白色，長期培養(yǎng)菌落偏棕黃色， 邊緣整齊，不透明，表面略褶皺。
[0009] 進(jìn)一步地，所述芽孢桿菌菌株革蘭氏染色呈紫色，為陽性；芽孢染色中芽孢呈綠 色，菌體呈紅色；芽孢桿菌菌株在需氧型試驗(yàn)結(jié)果為沿培養(yǎng)基表面生長，為好氧菌。
[0010] 本發(fā)明所述的芽孢桿菌制備的防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌劑。
[0011] 進(jìn)一步地，所述的防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌劑，其活性成分為如下（a)、（b)、 (c)和（d)中的至少一種：
[0012] (a)權(quán)利要求1所述芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物；
[0013] (b)權(quán)利要求1所述芽孢桿菌；
[0014] (c)權(quán)利要求1所述芽孢桿菌的芽孢；
[0015] (d)權(quán)利要求1所述芽孢桿菌的發(fā)酵上清。
[0016] 本發(fā)明所述的防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括如下步驟：
[0017] (1)將所述芽孢桿菌菌株JSCX-I為芽孢桿菌屬，芽孢桿菌菌種在NB培養(yǎng)基中上生 長，溫度為29-31°C，在轉(zhuǎn)速為150-180r/min下振蕩進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為16-20h，然后在 超凈工作臺(tái)中分別取樣測0D600值，測定過程中以未接菌的NB培養(yǎng)基來進(jìn)行比對；
[0018] (2)當(dāng)芽孢桿菌菌種培養(yǎng)至0D600值為0. 5-0. 8時(shí)，將芽孢桿菌菌種溶液與蒸餾水 按照1 :1〇〇的體積比加入NB培養(yǎng)基中，溫度為28-30°C、轉(zhuǎn)速為150-180r/min下振蕩培養(yǎng) 20-24h，
[0019] 然后在轉(zhuǎn)速為6000-8000r/min下進(jìn)行離心分離9-llmin，制得芽孢桿菌菌劑。
[0020] 進(jìn)一步地，在步驟（2)中，將芽孢桿菌菌劑的濃度稀釋至lX108-lX10 1(lCFU/ml。
[0021] 進(jìn)一步地，在步驟⑴中，所述NB培養(yǎng)基由牛肉浸膏2. 9-3. lg，蛋白胨 9. 9-10. lg，氯化鈉4. 9-5. Ig組成；pH為6. 8-7. 0,用蒸餾水將上述組分定容至1000ml，在 溫度為120_121°C下滅菌19-21min。
[0022] 本發(fā)明所述芽孢桿菌菌劑在防治大豆根腐病的應(yīng)用。
[0023] 有益效果：本發(fā)明不易使大豆疫霉產(chǎn)生抗性、不污染環(huán)境的防治大豆根腐病的芽 孢桿菌菌株及其芽孢桿菌菌劑。芽孢桿菌菌劑屬于生物制劑，完全沒有因化學(xué)藥劑的使用 所帶來的化學(xué)抗藥性等問題，因而有利于大豆的無公害生產(chǎn)。農(nóng)民可以不用或減少其他防 治大豆疫霉的農(nóng)藥的用量。減少農(nóng)民節(jié)省開支。同時(shí)，該芽孢桿菌菌劑的防治效果可達(dá) 50%以上，還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。芽孢桿菌菌劑對大豆根腐病的防治效果為 55-64%，農(nóng)業(yè)增產(chǎn)可達(dá)23 %以上。
【附圖說明】 圖I :JSCX-1基因組與同源性較高的菌株序列所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的具體描述，但不能理解為是對本發(fā)明 保護(hù)范圍的限定。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 菌株的生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA分子的鑒定
[0027] 如圖1所示，芽孢桿菌菌株JSCX-I在NA平板上在溫度為29-31°C下進(jìn)行活化培 養(yǎng)，NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏（Beef Extract)3g，蛋白胨（Peptone)lOg，氯化鈉（NaCl)5g，瓊脂 粉（Agar) 15g，ρΗ7· 0。
[0028] 培養(yǎng)時(shí)間為20_24h后觀察發(fā)現(xiàn)，JSCX-I的單菌落近圓形，乳白色，長期培養(yǎng)菌落 偏棕黃色，邊緣整齊，不透明，表面略褶皺。菌株JSCX-I革蘭氏染色呈紫色，為陽性；芽孢染 色中芽孢呈綠色，菌體呈紅色。菌株JSCX-I在需氧型試驗(yàn)結(jié)果為沿培養(yǎng)基表面生長，表明 菌株JSCX-I為好氧菌。
[0029] 生理生化試驗(yàn)為氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、H2S產(chǎn) 生試驗(yàn)的結(jié)果均為陽性；苯丙氨酸解氨酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰 甲基甲醇試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)，在耐鹽性試驗(yàn)中結(jié)果均為陰性。
[0030] 芽孢桿菌菌株JSCX-I能在含2%、5%、8% NaCl的NA培養(yǎng)基中生長，在含10% NaCl的NA培養(yǎng)基中無法生長，在葡萄糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)中糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基變黃色且倒 置的德漢氏小管有氣體產(chǎn)生。菌株JSCX-I的形態(tài)特征和生理生化特征與常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒 定手冊中芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.)最為相似。
[0031] 以JSCX-I基因組總DNA為模板，PCR擴(kuò)增16SrDNA得到長度約I. 5Kb的擴(kuò)增產(chǎn)物， 這與16SrDNA在所有細(xì)菌中大多高度保守并且長度恒定為I. 5Kb左右的報(bào)道吻合。整理測 序結(jié)果可得到進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的16SrDNA序列的總長度為1419bp，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng) 站GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast搜索，與已登錄的16SrDNA序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌 株JSCX-I的16SrDNA序列與多株芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.)相似度較高，下載與芽 孢桿菌菌株JSCX-I的16SrDNA序列同源性較高的序列，選取10株相似度最高的構(gòu)建系統(tǒng) 進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)菌株JSCX-I與Bacillus sp. Q2-S1 (JX994136. 1)處于同一分支上，同源性最 高，大于99%，結(jié)合培養(yǎng)特性及生理生化特征鑒定結(jié)果，將芽孢桿菌菌株JSCX-I初步鑒定 為芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus sp.)
[0032] 本發(fā)明不易使大豆疫霉產(chǎn)生抗性、不污染環(huán)境的防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌株 及其芽孢桿菌菌劑。芽孢桿菌菌劑屬于生物制劑，完全沒有因化學(xué)藥劑的使用所帶來的化 學(xué)抗藥性等問題，因而有利于大豆的無公害生產(chǎn)。農(nóng)民可以不用或減少其他防治大豆疫霉 的農(nóng)藥的用量。減少農(nóng)民節(jié)省開支。同時(shí)，該芽孢桿菌菌劑的防治效果可達(dá)50%以上，還有 增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。芽孢桿菌菌劑對大豆根腐病的防治效果為55-64%，農(nóng)業(yè)增 產(chǎn)可達(dá)23%以上。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 大豆疫霉游動(dòng)孢子懸浮液制備方法步驟如下：
[0035] (1)將保存的大豆疫霉菌株在V8培養(yǎng)基上活化生長，活化生長時(shí)間為5-6d。
[0036] (2)將番茄和萵苣洗凈晾干用組織攪碎機(jī)攪碎。用四層紗布過濾去渣。按照番茄 汁和萵苣汁1 :2的比例混合。
[0037] (3)按0.02 % (w/v)的比例加入CaCO3,再加入去離子水配制成50 %的蔬菜汁培 養(yǎng)基。溫度為120-122°C，滅菌時(shí)間為29-31min。
[0038] (4)將活化的大豆疫霉菌株在LBA培養(yǎng)基上，溫度為24-26°C，黑暗條件進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)時(shí)間為3-4d后用打孔器（d = 5_)沿菌落邊緣取菌碟。
[0039] (5)將4塊菌碟置于14-16ml培養(yǎng)基中，24-26°C，黑暗條件進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為 3 _4d〇
[0040] (6)傾去培養(yǎng)基，加入體積為19-21ml的滅菌水，間隔時(shí)間為12-14h再換一次滅菌 水。
[0041] (7)在溫度為24-26°C下，恒溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為20-24h，產(chǎn)生游 動(dòng)孢子囊。
[0042] (8)將游動(dòng)孢子囊懸浮液在轉(zhuǎn)速為3000-3200r/min下進(jìn)行勻漿lmin，用無菌水調(diào) 節(jié)至濃度約為IX IO4-IX l〇5CFU/ml。
[0043] 本發(fā)明的一種防治大豆根腐病的芽孢桿菌菌株，該菌株為芽孢桿菌（BaciLLus. sp);保藏名稱為芽孢桿菌JSCX-I ;保藏于中國