大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈抗性的aflp指紋圖譜構(gòu)建的制作方法
【專利說(shuō)明】大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構(gòu)建 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構(gòu)建。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 大豆疫霉菌（Phytophthorasojae)可引起大豆生產(chǎn)中危害極嚴(yán)重的大豆疫霉根 腐病，是中國(guó)對(duì)外公布的I類危險(xiǎn)性檢疫對(duì)象，也是內(nèi)檢對(duì)象。大豆疫病已成為我國(guó)大豆生 產(chǎn)上的突出問(wèn)題，給我國(guó)的大豆生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 大豆疫霉菌為土傳真菌，但病菌寄生性強(qiáng)，不能在土壤顆粒上競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)和定殖，卵 抱子在植株病殘?bào)w和土壤中能存活多年。大豆疫霉菌在利馬豆、玉米粉、V8汁等培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)較快，菌落均勻，邊緣整齊。菌絲寬3~9ym，易卷曲；菌絲體珊瑚狀，分枝近直角，在分枝 基部稍繞縮，老熟后產(chǎn)生隔膜；菌絲可形成結(jié)節(jié)狀、膨大體和厚垣抱子。孢囊梗簡(jiǎn)單，頂生游 動(dòng)孢子囊；游動(dòng)孢子囊倒梨形和橢圓形，無(wú)乳突；游動(dòng)抱子卵圓形，一端或兩端鈍圓，側(cè)面 平滑，有兩根鞭毛。周肇惠等研究證實(shí)卵孢子只產(chǎn)生于帶菌種子的種皮，檢測(cè)大豆種皮存在 卵孢子與否可以作為大豆種子帶菌檢測(cè)方法之一。1957年，Bernard發(fā)現(xiàn)了大豆對(duì)大豆疫霉 菌存在抗性分化。1959年Hildebrand發(fā)現(xiàn)不同大豆疫霉菌分離物在毒力上有差異，認(rèn)為大 豆疫霉菌存在生理株系。1965年Morgan和Hartwig首次報(bào)道了大豆疫霉菌的生理?；停?描述為1號(hào)和2號(hào)小種。1963年育成了含有單抗性Rps-I的大豆商業(yè)品種，此后的十年間抗 病品種在美國(guó)北部地區(qū)廣泛推廣種植，大豆疫霉根腐病得到了基本控制。但正是由于這些 抗病品種的廣泛應(yīng)用，對(duì)病原菌造成相對(duì)高的選擇壓，加速了大豆疫霉菌的毒力分化。1972 年，schmitthenner在美國(guó)北部地區(qū)發(fā)現(xiàn)對(duì)當(dāng)時(shí)推廣的帶有抗病基因的品種Harosoy63具 有毒力的分離物，并定名為3號(hào)小種，隨后4~9號(hào)小種也相繼在北部地區(qū)和加拿大被鑒 定。此后，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言抗病品種一小種互作下新的大豆疫 霉菌生理小種便不斷，其變異速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于從1號(hào)、2號(hào)小種到3號(hào)小種的變異。有研究認(rèn) 為，在土壤中還可能存在更為豐富的生理小種多樣性，由于田間種植品種的同質(zhì)性較高，存 在于土壤中的許多小種尚不能通過(guò)田間發(fā)病植株的分離來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。大豆疫霉菌是具有寄 主?；缘闹虏【Ｒ延械难芯勘砻?，大豆疫霉菌與大豆品種之間的互作具有基因?qū)?的特征。在與寄主抗病性互作中，大豆疫霉菌毒力也在演變和快速進(jìn)化，新的生理小種不斷 出現(xiàn)，而且在大豆抗病性利用越多的地區(qū)，大豆疫霉菌的毒力變異就越快。至2000年，通過(guò) 在13個(gè)大豆疫霉菌生理小種鑒別寄主上接種鑒定，國(guó)際上已報(bào)道了 63個(gè)大豆疫霉菌生理 小種，許多研究者還報(bào)道了更多的毒力基因類型。事實(shí)上，一些研究者己直接從土壤中分離 鑒別出許多新生理小種。大豆疫霉菌分離物在實(shí)驗(yàn)室條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的保存，也會(huì)在 致病毒性上發(fā)生變異，產(chǎn)生新生理小種。
[0004]目前，防治大豆疫病主要是通過(guò)選用抗病品種和使用化學(xué)藥劑。使用抗病品種是 最經(jīng)濟(jì)，有效的防治途徑。但是，目前培育的抗病品種大多為單基因控制的垂直抗性，生產(chǎn) 中缺乏有效的持久性抗病品種；同時(shí)大豆疫霉菌的變異常導(dǎo)致抗病品種抗性的喪失，而且 目前在商業(yè)上推廣使用的農(nóng)藝性狀好的品種大多都是感病品種，這些因素的存在給大豆抗 病品種的培育和推廣帶來(lái)了困難。因此，化學(xué)藥劑防治在大豆疫病的防治中占有重要地位。 目前大豆疫病已成為我國(guó)大豆生產(chǎn)上的突出問(wèn)題，給我國(guó)的大豆生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損 失。
[0005] 甲霜靈（Metalaxyl)屬于苯酰胺類內(nèi)吸殺菌劑，具有低毒、高效和持效期長(zhǎng)等特 性，尤其對(duì)卵菌綱中的霜霉屬、疫霉屬和腐霉屬的病原菌具有很強(qiáng)的活性。已被廣泛應(yīng)用于 包括大豆疫霉菌在內(nèi)的卵菌所致植物病害的防治。但隨著甲霜靈的普遍使用，病原菌的抗 藥性問(wèn)題接踵而來(lái)，病原菌的抗藥性發(fā)展速度非常之快，使得病原菌對(duì)甲霜靈的抗藥性問(wèn) 題在同類殺菌劑中也顯得最為突出。實(shí)驗(yàn)表明在甲霜靈的壓力下，我國(guó)大豆疫霉菌在田間 可能產(chǎn)生抗性突變體，存在產(chǎn)生抗性群體的風(fēng)險(xiǎn)。到目前為止，已經(jīng)有許多研究方法用于大 豆疫霉菌的檢測(cè)鑒定，但現(xiàn)有的大豆疫霉菌檢測(cè)技術(shù)存在許多不足之處，主要是檢測(cè)的靈 敏度和準(zhǔn)確性低，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適應(yīng)檢疫部門特別是口岸快速檢測(cè)的要求，也無(wú)法通過(guò)建 立抗性監(jiān)測(cè)體系來(lái)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。
[0006] 迄今為止，植物病原真菌的分類鑒定主要依據(jù)其營(yíng)養(yǎng)體和子實(shí)體的形態(tài)特征，大 豆疫霉菌也不例外。傳統(tǒng)的大豆疫霉的檢測(cè)方法是通過(guò)分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察形態(tài)及簡(jiǎn)單 的生理性狀測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而由于形態(tài)特征容易受到培養(yǎng)條件和其它因素的影響，而且許 多子實(shí)體類型經(jīng)常難以獲得，故給鑒定工作帶來(lái)困難。大豆疫霉菌生長(zhǎng)緩慢，以卵孢子存在 于土壤中，條件適宜時(shí)萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子侵染大豆根系導(dǎo)致根部腐爛。由于患病部位經(jīng)常 感染其它大豆根腐病菌和腐生菌，因此分離培養(yǎng)和純化有一定難度，一般采用的病土中種 植感病的品種或用葉碟法誘捕土壤中的病菌游動(dòng)孢子，然后用含有多種抗菌素的培養(yǎng)基從 發(fā)病的植株或葉碟中分離并純化病原菌。上述方法雖然可以有效檢測(cè)大豆疫霉菌，但所需 時(shí)間長(zhǎng)、程序繁瑣、靈敏度低。
[0007] 隨著血清學(xué)技術(shù)和核酸技術(shù)的研究及應(yīng)用，使真菌檢測(cè)鑒定方法在快速、靈敏方 面有了更大發(fā)展。近年來(lái)，有關(guān)利用血清技術(shù)檢測(cè)疫霉菌（包括大豆疫霉菌）的報(bào)道較多， 但血清學(xué)方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)則有很多困難，主要是多克隆抗體抗血清效價(jià)不高、特異性不 強(qiáng)，很難達(dá)到實(shí)際應(yīng)用水平；單克隆抗體又過(guò)于單一（可能是屬級(jí)水平，也可能是種級(jí)水平 甚至生理小種級(jí)水平），在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，難于應(yīng)用。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)大豆疫霉菌變異的檢測(cè)方法和技術(shù)。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜 構(gòu)建方法，、采用大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈的抗藥性穩(wěn)定突變體，進(jìn)行AFLP指紋圖譜構(gòu)建并獲 得特異性條帶；
[0010] 抗藥性穩(wěn)定突變體的篩選采用：甲霜靈馴化誘導(dǎo)，甲霜靈直接誘變和EMS化學(xué)誘 變，將獲得的抗甲霜靈突變體進(jìn)行穩(wěn)定性分析并測(cè)定其對(duì)甲霜靈的抗性水平；
[0011]AFLP指紋圖譜的構(gòu)建包括下述步驟：利用優(yōu)化體系引物組合構(gòu)建誘導(dǎo)錢的野生 菌株和誘導(dǎo)后的抗性菌株不同引物組合的DNA指紋圖譜，獲得特異性條帶。
[0012] 本發(fā)明提供的大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構(gòu)建方法，其中，抗藥性 穩(wěn)定突變體的篩選方式為：
[0013] 甲霜靈馴化誘導(dǎo)：將供試菌株置于胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA)上，25°C、黑暗培養(yǎng) 6-8d，然后移入含有0.lug/mL甲霜靈的CA平板上，8d后將在含甲霜靈平板上生長(zhǎng)相對(duì) 較快的菌絲塊轉(zhuǎn)移至含有相同含量的甲霜靈平板上，以后每隔8d轉(zhuǎn)1次，并逐漸增大甲霜 靈的含量，直至能在含10 Ug/mL甲霜靈的CA平板上生長(zhǎng)，從而獲得馴化抗性突變菌株；
[0014] 甲霜靈抗性突變株的直接誘導(dǎo)：將供試菌株置于CA平板上，25°C、黑暗培養(yǎng)6-8d， 然后移入含有甲霜靈〇. 1Ug/mL的CA上，每培養(yǎng)皿接種4塊，每菌株接種10個(gè)培養(yǎng)皿， 接種后的培養(yǎng)皿用封口膜封口，置25°C黑暗培養(yǎng)，3d后每隔Id觀察菌絲塊生長(zhǎng)情況。將各 菌株菌絲塊邊緣產(chǎn)生的快速生長(zhǎng)角變區(qū)分別移至含甲霜靈〇.lug/mL的CA上，能較好生 長(zhǎng)的菌株即可能為突變菌株，直至找到能在含10Ug/mL甲霜靈的CA平板上生長(zhǎng)的抗性 菌株為止；
[0015] 甲霜靈抗性突變株的化學(xué)誘導(dǎo)采用甲基磺酸乙酯（EMS)化學(xué)誘變劑處理大豆疫 霉菌游動(dòng)孢子懸浮液，然后涂布在含甲霜靈的CA培養(yǎng)基上，篩選抗性突變體。
[0016] 本發(fā)明提供的大豆疫霉菌對(duì)甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構(gòu)建方法，其中，AFLP指 紋圖譜的構(gòu)建按如下步驟進(jìn)行：
[0017] 1.提取抗性突變菌株DNA，制備高純度DNA樣品備用；
[0018] 1)酶切連接：反應(yīng)體系 50iiL:DNA50ng，EcoRI12U，MseI10U，BSA1.g，NEB Buffer;加入 10iiL連接混合液：EcoRI接頭 5pmol和MseI接頭 50pmol，ATP10pmol，T4DNA 連接酶3U，充分混勻離心，分別37°C水浴6h;
[0019] 2)預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)：取5yL連接后的DNA樣品，加入15yL預(yù)擴(kuò)增混合液：EcoRI預(yù)擴(kuò) 引物和MseI預(yù)擴(kuò)引物各 75ng，lXPCRBuffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混勻后，94°C30s， 56°C30s，72°C60s，循環(huán)30個(gè)；取5iiL預(yù)擴(kuò)增稀釋產(chǎn)物，加入15iiL選擇性擴(kuò)增混合液： dNTP4nmol，引物混合液 0.5iiL，Taq酶 0.5U，1XPCRBuffer，混勻后，94°C30s，65°C30s， 72°C60s，12 個(gè)循環(huán)后變?yōu)椋?4°C30s，56°C30s，72°C60s，23 個(gè)循環(huán)；加入