CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建染色體易位干細(xì)胞及動(dòng)物模型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及在干細(xì)胞中通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建特異 位點(diǎn)染色體易位，以及用干細(xì)胞構(gòu)建特異位點(diǎn)染色體易位的動(dòng)物模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體易位（Chromosome Translocation)，即染色體片段位置的改變，是最常 見(jiàn)的染色體異常（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Braude, P·，Pickering, S·，F(xiàn)linter, F·，and Ogilvie, C. M. (2〇〇2)· Preimplantation genetic diagnosis. Nat Rev Genet 3, Ml-%3)。其產(chǎn)生過(guò) 程往往是不同染色體位點(diǎn)的DNA雙鏈發(fā)生斷裂（double-strand breaks，DSBs)，然后不同 的染色體斷端經(jīng)由非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ)機(jī)制修復(fù)，造成 染色體片段位置的改變（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Roukos, V. ,and Misteli，T. (2014).The biogenesis of chromosome translocations. Nat Cell Biol 16,293-300·)。染色體易位可發(fā)生在不 同的染色體之間，也可發(fā)生于同一染色體的不同位置，使得基因的位置發(fā)生改變，往往產(chǎn)生 基因的突變和融合基因。
[0003] 染色體易位事件可能發(fā)生在細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，使得生殖細(xì)胞攜帶易位染色體， 進(jìn)而傳到后代個(gè)體的每個(gè)細(xì)胞，包括后代個(gè)體的生殖細(xì)胞，并可能進(jìn)一步遺傳下去。染色體 易位事件也可能發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂時(shí)期，使得個(gè)體的部分細(xì)胞攜帶易位染色體。
[0004] 由于染色體易位發(fā)生的位置千差萬(wàn)別，因此對(duì)個(gè)體健康的影響也有很大的差 異。很多攜帶平衡染色體易位的個(gè)體往往表現(xiàn)正常，但很多染色體易位也能導(dǎo)致疾病， 比如不孕不育（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Fraccaro, M.，Maraschio, P.，Pasquali, F.，Tiepolo, L.，Z uffardi, 0. , and Giarola, A. (1973). Male infertility and 13-Htrans Io cat ion. Lancet I, 488)，唐氏綜合癥（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Prasher, V. P. (1993) · Presenile dementia associated with unbalanced Robertsonian translocation form of Down's syndrome. Lancet 342, 686-687)，精神分裂癥，以及多種腫瘤（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Bunting, S. F.，and Nussenzweig,A. (2013). End-joining,translocations and cancer. Nat Rev Cancer 13,443-454)。而且也由于染色體易位發(fā)生的位置千差萬(wàn)別，不斷有新的染色體易位被發(fā) 現(xiàn)，并伴有不同的臨床癥狀（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Imataka, G·，Okuya, M·，Hirao, J·，and Arisaka, 0· (2014). Terminal deletion 6q syndrome with Ilq partial trisomy mosaicism due to maternal balanced translocation. Genet Couns 25,63-67)。因此，對(duì)染色體易位的研宄 有重要的意義。然而，由于技術(shù)的限制，一直沒(méi)有容易的方法建立染色體易位的細(xì)胞或者動(dòng) 物模型，用于染色體易位的研宄以及藥物的篩選等應(yīng)用。
[0005] 小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells，mESCs)是分離于小鼠胚胎囊 胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的特殊干細(xì)胞，其明顯的優(yōu)勢(shì)和獨(dú)特的特點(diǎn)是可以分化為小鼠個(gè)體的一切細(xì) 胞類(lèi)型，并具有無(wú)限增殖并維持其多能性的能力。因此 mESCs被廣泛用于各種細(xì)胞模型的 建立，也可以定向分化mESCs得到研宄者感興趣的細(xì)胞，比如某些難以分離，原代培養(yǎng)的細(xì) 胞，尤其是要經(jīng)過(guò)篩選得到基因修改或基因敲除的細(xì)胞，而該類(lèi)型細(xì)胞又沒(méi)有很好的分裂 能力時(shí)，利用mESCs進(jìn)行基因修改和篩選，再誘導(dǎo)其分化為該類(lèi)型細(xì)胞就成了幾乎唯一的 選擇。mESCs還被廣泛用于各種基因敲除小鼠和基因修飾小鼠動(dòng)物模型的建立（參見(jiàn)文 獻(xiàn)：Ben-David, U.，0· Kopper, and N. Benvenisty. (2012). Expanding the boundaries of embryonic stem cells. Cell Stem Cell 10 (6)，666-77)。如果我們能在胚胎干細(xì)胞中人 工介導(dǎo)任意兩染色體位點(diǎn)的染色體易位，那么上文中一直沒(méi)有容易的方法建立染色體易位 的細(xì)胞或者動(dòng)物模型的問(wèn)題就迎刃而解了。
[0006] CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic rep eat (CRISPR) -CRISPR-associated endonuclease (Cas9))技術(shù)是近年出現(xiàn)的革命性的 基因編輯技術(shù)。該技術(shù)可以快速，容易的實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA序列在精確的位點(diǎn)進(jìn)行編輯， 包括突變，修改，插入等改變，使得生命的遺傳密碼可以按照人類(lèi)的意愿改變。（參見(jiàn)文 獻(xiàn):Hsu, P. D. , Lander, E. S. , and Zhang, F. (2014). Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering. Cell 157,1262-1278)。該技術(shù)主要是通過(guò)向細(xì) 胞內(nèi)導(dǎo)入引導(dǎo)核糖核酸（Single-guide RNA，gRNAs)和Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的切 害J。gRNA是一個(gè)經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)的向?qū)NA，可以識(shí)別并結(jié)合靶基因 DNA序列；Cas9蛋白 是一個(gè)酶，其帶有一個(gè)核定位信號(hào)，以確保在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的核中表達(dá)；可以與gRNA以及 其識(shí)別的DNA結(jié)合，將目的DNA序列切斷，在設(shè)計(jì)的位置上精準(zhǔn)的介導(dǎo)DNA序列的DSBs， 再利用細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)機(jī)制以及同源重組等機(jī)制，對(duì)DNA在斷裂位點(diǎn)及附近進(jìn)行突 變，插入，替換等等修改，實(shí)現(xiàn)基因編輯的目的（參見(jiàn)文獻(xiàn)：Mali，P.，Yang，L.，Esvelt，K. Μ. , Aach, J. , Guell, Μ. , DiCarlo, J. Ε. , Norville, J. Ε. , and Church, G. Μ. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826)〇
[0007] 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN201310625372. 9,發(fā)明名稱(chēng)為"一種玉米基因組定點(diǎn)改造方法"，[0008] 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN 201410438927. 3,發(fā)明名稱(chēng)為"白化病模型豬的重構(gòu)卵及其構(gòu)建 方法和模型豬的構(gòu)建方法"，公開(kāi)號(hào)為CN 104263754A，公開(kāi)了一種白化病模型豬的重構(gòu)卵 的構(gòu)建方法，是通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)將gRNA和Cas9的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染微型豬胎兒成纖維 細(xì)胞，篩選出酪氨酸酶基因敲除的陽(yáng)性克隆細(xì)胞，再將陽(yáng)性克隆細(xì)胞注入母豬的去核卵母 細(xì)胞中，形成重構(gòu)卵，獲得TYR基因敲除豬具有典型白化特征。
[0009]目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)CRISPR_Cas9技術(shù)用于在干細(xì)胞中人工介導(dǎo)染色體易位的 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，也無(wú)報(bào)道用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得攜帶人工介導(dǎo)染色體易位的干細(xì)胞進(jìn)一 步產(chǎn)生染色體易位動(dòng)物模型的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種在干細(xì)胞中通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)特異位點(diǎn)的 染色體易位的方法，本發(fā)明的另一目的是利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建攜 帶特異位點(diǎn)的染色體易位的動(dòng)物模型的方法，本發(fā)明的第三目的是提供所述方法在構(gòu)建特 異位點(diǎn)染色體易位干細(xì)胞模型及動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
[0011] 申請(qǐng)人設(shè)想，既然CRISPR-Cas9技術(shù)可以介導(dǎo)特異DNA序列的DSBs，而染色體易 位也是因?yàn)椴煌旧w位點(diǎn)的DSBs觸發(fā)的，那么是否可以利用CRISPR-Cas9技術(shù)在干細(xì)胞 (特別是胚胎干細(xì)胞）中對(duì)不同染色體位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異的切割，從而按照人們的意愿，人 工介導(dǎo)任意兩染色體位點(diǎn)的染色體易位，從而得到各種類(lèi)型的染色體易位細(xì)胞模型，以及 用該攜帶染色體易位的動(dòng)物的干細(xì)胞制作攜帶染色體易位的動(dòng)物模型？
[0012] 本發(fā)明首次在干細(xì)胞中用CRISPR_Cas9技術(shù)產(chǎn)生染色體易位，以及用這樣的干細(xì) 胞構(gòu)建動(dòng)物模型。
[0013] 本發(fā)明的第一方面，提供一種在干細(xì)胞中通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)特異位點(diǎn)的 染色體易位的方法，包括如下步驟：
[0014] A、確定想要誘導(dǎo)的染色體易位的兩個(gè)染色體位點(diǎn)，標(biāo)記為chr-sitel、chr_site2 ; 根據(jù)目標(biāo)染色體位點(diǎn)（chr-sitel、chr-site2)分別設(shè)計(jì)gRNA的識(shí)別序列，標(biāo)記為gRNA-1、 gRNA-2 ；
[0015] B、構(gòu)建表達(dá)gRNA-Ι、gRNA-2的表達(dá)載體；
[0016] C、將步驟B得到的表達(dá)gRNA-l、gRNA-2的表達(dá)載體，以及含Cas9基因的表達(dá)載體 共轉(zhuǎn)染目標(biāo)干細(xì)胞。
[0017] 本發(fā)明的方法還進(jìn)一步包括：
[0018] D、根據(jù)目標(biāo)染色體位點(diǎn)（chr-sitel、chr_site2)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，其中一個(gè)引物位 于chr-sitel附近，標(biāo)記為P1，另一個(gè)引物位于chr-site2附近，標(biāo)記為P2,鑒定染色體易 位是否成功；
[0019] E、克隆化攜帶目標(biāo)染色體易位的干細(xì)胞系。
[0020] 本發(fā)明所述的目標(biāo)干細(xì)胞，具體為：跟據(jù)需要確定想要攜帶特異位點(diǎn)染色體易位 的干細(xì)胞類(lèi)型、種屬，可以是胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造 血干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞等等。如果需要獲得攜帶某染色體易位的干細(xì)胞模型（細(xì)胞模型）， 可以選擇各種種屬的干細(xì)胞，包括人的干細(xì)胞，如果還需要進(jìn)一步獲得攜帶染色體易位的 動(dòng)物模型，則可以選擇動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。選擇好干細(xì)胞類(lèi)型后，可通過(guò) 商業(yè)途徑，或根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法自己分離培養(yǎng)獲得該目標(biāo)