[0060] 1.消化mESCs-T (5:7) -I-GFP細(xì)胞，用顯微注射方法將該細(xì)胞注入E3. 5天的 小鼠囊胚中，并將胚胎移植到代孕小鼠子宮，待嵌合體胚胎發(fā)育到E13. 5天，將代孕小鼠 處死，取出胚胎，熒光顯微鏡下鏡檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎中出現(xiàn)GFP陽性的組織如圖4。說明 mESCs-T (5:7) -I-GFP細(xì)胞可以參與胚胎發(fā)育，產(chǎn)生嵌合體小鼠胚胎。
[0061] 2.取出嵌合體胚胎部分組織，用于基因組DNA抽提，并用針對這一優(yōu)選實(shí)例所設(shè) 計(jì)的Pl，P2引物，通過PCR和測序的方法檢測到該嵌合體組織中存在5號(hào)染色體和7號(hào)染 色體的易位如圖5。說明成功構(gòu)建部分細(xì)胞中攜帶特異位點(diǎn)染色體易位的小鼠嵌合體模型。 熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，得到了染色體易位的嵌合體小鼠，再通過與正常小鼠雜交，可 得到雜合子小鼠，即得到每個(gè)細(xì)胞都攜帶特異位點(diǎn)的染色體易位的小鼠模型。如有需要，還 可以將雜合子自交，得到純合的攜帶染色體易位的小鼠模型。
[0062] 本發(fā)明的第三方面，提供所述第一方面和第二方面所述方法所構(gòu)建的特異位點(diǎn)染 色體易位干細(xì)胞模型及動(dòng)物模型在染色體易位的研宄，融合基因的研宄，染色體相互作用 的研宄，動(dòng)物育種，以及藥物的篩選、評價(jià)中的應(yīng)用。
[0063] 例如：可構(gòu)建識(shí)別人21號(hào)染色體和14號(hào)染色體特異位點(diǎn)的gRNA，采用本方法第 一方面，構(gòu)建T (14:21)干細(xì)胞模型來研宄唐氏綜合癥，構(gòu)建識(shí)別人22號(hào)染色體和9號(hào)染色 體特異位點(diǎn)的gRNA，構(gòu)建T (9:22)干細(xì)胞模型來研宄白血病，構(gòu)建識(shí)別小鼠2號(hào)染色體和 10號(hào)染色體的特異位點(diǎn)的gRNA，構(gòu)建T (2:10)小鼠模型，或構(gòu)建T (9:22)黑猩猩模型來研 宄白血病，以及其治療藥物的篩選和治療效果的評價(jià)等。
【附圖說明】
[0064] 圖1為在小鼠胚胎干細(xì)胞中成功誘導(dǎo)5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位的PCR及測序 鑒定結(jié)果；其中A:利用針對5號(hào)染色體與7號(hào)染色體的引物Pl，P2做PCR鑒定的結(jié)果。由 于正常情況下Pl，P2所能結(jié)合的DNA模板位于不同的染色體，因此在對照mESCs細(xì)胞中不 能擴(kuò)增出任何條帶，只有發(fā)生5號(hào)染色體與7號(hào)染色體在設(shè)計(jì)位點(diǎn)易位，才能擴(kuò)增出條帶， 圖中可見當(dāng)向mESCs中導(dǎo)入Cas9和兩個(gè)gRNA后，可以可以擴(kuò)增出條帶，且條帶大小同預(yù)期 一致；B:將PCR產(chǎn)物回收測序后的結(jié)果，可見所測序列有一半與小鼠5號(hào)染色體上設(shè)計(jì)位 置完全一致，一半與小鼠7號(hào)染色體上設(shè)計(jì)位置完全一致，說明染色體易位發(fā)生的位點(diǎn)精 確位于設(shè)計(jì)位點(diǎn)。
[0065] 圖2為在小鼠胚胎干細(xì)胞中成功誘導(dǎo)5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位的Chromosome Painting鑒定結(jié)果；Chromosome Painting技術(shù)可以將整條染色體標(biāo)上焚光；圖中小鼠5號(hào) 染色體被標(biāo)上紅色熒光，小鼠7號(hào)染色體被標(biāo)上綠色熒光；其中A :對照組小鼠胚胎干細(xì)胞 染色體Chromosome Painting結(jié)果?？梢娦∈?號(hào)染色體和7號(hào)染色體獨(dú)立分開存在；B : 導(dǎo)入Cas9和兩條設(shè)計(jì)gRNA后的小鼠胚胎干細(xì)胞染色體Chromosome Painting結(jié)果?？梢?一條小鼠5號(hào)染色體的大部分與7號(hào)染色體的大部分相連而成一條較大的易位染色體。
[0066] 圖3為經(jīng)單克隆化后，從每個(gè)克隆中分別提取DNA并用Pl，P2檢測5號(hào)染色體與 7號(hào)染色體易位的結(jié)果；圖中標(biāo)記" + "的組是單克隆化前的攜帶染色體易位的mESCs細(xì)胞 組，作為陽性對照，可見三個(gè)mESCs克隆攜帶5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位；分別命名為 mESCs-T(5:7)-l，mESCs-T(5:7)-2, mESCs-T(5:7)-3。
[0067] 圖4為攜帶5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位的嵌合體小鼠胚胎熒光鏡檢結(jié)果；嵌合 體小鼠胚胎來源于在E3. 5天時(shí)注射了 mESCs細(xì)胞后的小鼠囊胚；該mESCs攜帶5號(hào)染色 體與7號(hào)染色體易位，并穩(wěn)定表達(dá)GFP ;其中A :注射了 mESCs細(xì)胞后的E13. 5天的小鼠胚 胎，小圖中顯示的是剛顯微注射后E3. 5天的小鼠囊胚；B :明視野下的注射過mESCs的小鼠 E13. 5天的小鼠胚胎組織；C:綠色熒光視野下的注射過mESCs的小鼠 E13. 5天的小鼠胚胎 組織；圖中可見一塊組織顯示GFP陽性；說明攜帶5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位的mESCs參 與胚胎的發(fā)育，所見的胚胎為嵌合體胚胎；D :明視野及綠色熒光視野merge后的結(jié)果。
[0068] 圖5為嵌合體小鼠胚胎組織5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位的PCR及測序鑒定結(jié)果； 其中A:利用針對5號(hào)染色體與7號(hào)染色體的引物P1，P2做PCR鑒定的結(jié)果；圖中可見嵌合 體小鼠胚胎組織中抽提的DNA可以擴(kuò)增出條帶，且條帶大小同預(yù)期一致；B:將PCR產(chǎn)物回 收測序后的結(jié)果，可見所測序列與攜帶染色體易位的mESCs中所測結(jié)果一致；說明嵌合體 小鼠胚胎攜帶5號(hào)染色體與7號(hào)染色體易位，且易位發(fā)生在設(shè)計(jì)位點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0069] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0070] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除 非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此 外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí) 施方法與材料僅作示范之用。
[0071] 實(shí)施例1 :小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs)的分離、培養(yǎng)與傳代。
[0072] 按照文獻(xiàn)報(bào)道方法從分離小鼠胚胎干細(xì)胞，其具體方法可以參考： Czechanskij A. , et al. , Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Protocj 2014. 9(3):p. 559-74. 小鼠胚胎干細(xì)胞分離后，按如下方法培養(yǎng)：
[0073] 在0. 1 %明膠包被的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，其培養(yǎng)基為mES培養(yǎng)基，并置于5% CO2、 37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；所述的mES培養(yǎng)基為含有1%非必要氨基酸（Invitrogen)，10% 胎牛血清（HyClone)，0· ImM β-疏基乙醇（Invitrogen)，2mM GlutaMax(Invitrogen),以及 100單位/ml白血病抑制因子的GMEM培養(yǎng)基（Sigma, G5414)。
[0074] 培養(yǎng)的mESCs克隆與克隆間將要融合時(shí)，需要傳代，一般2-3天傳代一次，其具體 的方法為：
[0075] 1.去除培養(yǎng)基，并用PBS(不含鈣鎂）細(xì)一遍；
[0076] 2.加入胰酶EDTA(Gibco)覆蓋細(xì)胞克隆。37°C消化5分鐘。
[0077] 3.加入含血清的mES培養(yǎng)基，輕柔吹打是細(xì)胞與細(xì)胞間充分解離。
[0078] 4.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，1300轉(zhuǎn)離心3分鐘；
[0079] 5.棄上清，用mES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并細(xì)胞計(jì)數(shù)；
[0080] 6.將接種于明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，接種密度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 培養(yǎng)。
[0081] 實(shí)施例2 :設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對小鼠7號(hào)染色體與5號(hào)染色體的gRNA表達(dá)載體。
[0082] 本實(shí)施例以在胚胎干細(xì)胞中構(gòu)建小鼠 7號(hào)染色體與5號(hào)染色體易位為目標(biāo)。
[0083] 設(shè)計(jì)的7號(hào)染色體易位位點(diǎn)位于GSK3a基因所在位點(diǎn)上，具體為： chr7:25235652-25235624,其位點(diǎn)序列為：25235652~GATTGGTAATGGCTCATTCGG~25235632， 其 gRNA 的設(shè)計(jì)識(shí)別位點(diǎn)為：GATTGGTAATGGCTCATT(SEQ ID NO :1)
[0084] 設(shè)計(jì)的5號(hào)染色體易位位點(diǎn)位于⑶X2基因所在位點(diǎn)上，具體為：chr5 :
[0085] 147306976-147306947，其位點(diǎn)序列為：147306976-GTGAGCTACCTTCTGGACAA GG-147306955,其 gRNA 的設(shè)計(jì)識(shí)別位點(diǎn)為：GTGAGCTACCTTCTGGACA(SEQ ID NO :2)
[0086] 設(shè)計(jì)完成后，委托DNA合成公司，分別按序列5合成針對7號(hào)染色體的gRNA-Ι的表 達(dá)DNA序列，按序列6合成針對5號(hào)染色體的gRNA-2的表達(dá)DNA序列，序列包括上游的U6 啟動(dòng)子元件，識(shí)別序列，向?qū)NA骨架序列，以及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列元件。所述的方法參見 Addgene 網(wǎng)站：（http://www. addgene.org/static/cms/files/hCRISPR_gRNA_Synthesis. pdf)。包括完整gRNA表達(dá)元件的DNA合成好后，然后按照常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)步驟將gRNA-1， 構(gòu)建到載體PLKO-bsd中，將gRNA-2,構(gòu)建到載體PLKO-puro中。測序正確后，兩表達(dá)載體備 用。
[0087] 實(shí)施例3 :通過CRISPR/Cas9技術(shù)在小鼠胚胎干細(xì)胞中誘導(dǎo)7號(hào)染色體與5號(hào)染 色體特異位點(diǎn)易位。
[0088] 一、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
[0089] 小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs)分兩組，一組實(shí)驗(yàn)組，另一組為對照組，培養(yǎng)于mES培 養(yǎng)基中，置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。當(dāng)兩組細(xì)胞密度達(dá)到約50%，利用 Lipofectamine2000試劑（美國Invitrogene公司），按照轉(zhuǎn)染試劑說明書的步驟和試劑比 例，分別轉(zhuǎn)染。其中實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染gRNA-1，gRNA-2表達(dá)載體，和Cas9表達(dá)載體（購自Addgene Plasmid ID號(hào)：41815)，對照組只轉(zhuǎn)染Cas9表達(dá)載體。
[0090] 二、染色體特異位點(diǎn)易位鑒定
[0091] (I)PCR鑒定特異位點(diǎn)的染色體易位
[0092] 根據(jù)設(shè)計(jì)的gRNA識(shí)別位點(diǎn)，如果成功誘導(dǎo)7號(hào)染色體與5號(hào)染色體在設(shè)計(jì)的位 點(diǎn)發(fā)生染色體易位，那么7號(hào)染色體的chr7:25235632位點(diǎn)以前的序列就和5號(hào)染色體的 chr5 :147306976之后的序列就連