專利名稱：基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)座元件(transposable element),是廣泛分布于真核生物中的一類可移動(dòng)的DNA片段，最早由美國(guó)冷泉港生物實(shí)驗(yàn)室著名遺傳學(xué)家B.Mc Clintock在玉米中發(fā)現(xiàn)。MITE(miniature inverted repeat transposable element),即為轉(zhuǎn)座子，是 Bureau 等新近發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)座元件，其結(jié)構(gòu) 與非自主元件相似，具有TIR或TSD結(jié)構(gòu)，但又具有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件的高拷貝性。MITE廣泛分布在植物和動(dòng)物的基因組中，并且多存在于基因富集區(qū)，推測(cè)其對(duì)基因組進(jìn)化和基因表達(dá)等具有較大的影響。目前，MITEs已在許多生物體中發(fā)現(xiàn)，如水稻、秀麗隱桿線蟲、蚊子、人、真菌。MITE的長(zhǎng)度較短，一般為100 700bp，不能編碼轉(zhuǎn)座酶。它具有末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(terminal inverted repeats,TIRs)和祀位點(diǎn)重復(fù)(target siteduplication,TSD)，并且能形成穩(wěn)定的發(fā)夾式的二級(jí)結(jié)構(gòu)。它傾向于插入到基因的內(nèi)含子區(qū)或基因的5'和3'末端，但很少插入基因編碼區(qū)，有的也能形成巢式結(jié)構(gòu)。不同的MITE家族具有他們特異的TIRs和TSD。根據(jù)TSD序列的保守性，植物中的MITE被分為Tourist(具有3bp的TSD，TAA或TTA)和Stowaway (2bpTSD，TA)兩大類。TIR是確定MITE不同家族的主要依據(jù)，不同物種的MITE元件TIR序列具有同源性。MITE拷貝數(shù)多，本身具有多態(tài)性并能產(chǎn)生插入多態(tài)性，可以揭示出種內(nèi)和種間豐富的多態(tài)性信息，在遺傳多樣性和系譜分析研究中是一種有效的分子標(biāo)記，具有一定的開發(fā)潛力。MITE在基因組中拷貝數(shù)很高，不同的MITE亞族成員具有成百上千個(gè)拷貝甚至更高。MITE以多拷貝分布在植物的各條染色體中，因此被視為進(jìn)行精細(xì)多態(tài)性及遺傳關(guān)系分析的良好工具。CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六燒基三甲基溴化銨)方法是一種DNA提取經(jīng)典方法，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種MITE特異性引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，并且該檢測(cè)方法新穎、靈敏度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，按照如下步驟完成:(I )、用CTAB方法提取家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA ；(2)、用MseI酶完全消化步驟(I)所得的家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA，并與接頭引物混合連接，形成連接混液，具體反應(yīng)為0.5ml離心管中加入下列反應(yīng)物并且混合均勻:接頭引物:5'-CAGGGTGGGCAAA-3'SEQ NO I ；
權(quán)利要求
1.種基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，其特征在于，按照如下步驟完成: (1)、用CTAB方法提取家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA； (2)、用MseI酶完全消化步驟(1)所得的家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA，并與接頭引物混合連接，形成連接混液，具體反應(yīng)為0.5ml離心管中加入下列反應(yīng)物并且混合均勻:
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，其特征在于:所述微孢子蟲特異性MITE分型法檢測(cè)引物核苷酸序列: NbME5 特異引物:5' -AAAGTTTGCCCACCCCTG-3'SEQ N02 ； NbMEl 特異性引物:5' -CCCTTGGGAAACACTG-3'SEQ N03 ； 接頭引物:5' -CAGGGTGGGCAAA-3'SEQ NOl ； 錨定引物 1:5' -CAGGGTGGGCAAACT-3'SEQ N04 ； 錨定引物 2:5' -CAGGGTGGGCAAACA-3'SEQ N05 ； 是通過分析測(cè)序的家蠶微孢子蟲全基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)過生物信息學(xué)分析微孢子蟲的基因組而設(shè)計(jì)得到的該組微孢子蟲特異性MITE分型法檢測(cè)引物。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(3)中的步驟B，離心的條件轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為8 10s。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(4)中的步驟B，離心的條件轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)，離心時(shí)間為8 10s。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的基于轉(zhuǎn)座子 的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(I)中，家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA可以為小量樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于轉(zhuǎn)座子的分子引物對(duì)家蠶微孢子蟲的分型檢測(cè)方法，按照如下步驟完成(1)用CTAB方法提取家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA；(2)用MseI完全消化步驟(1)所得的家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA，然后與接頭引物等混合形成20μl的反應(yīng)體系；(3)連接有接頭的家蠶樣本微孢子蟲的基因組DNA使用的接頭引物和MITE特異性引物在25μl反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增；(4)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍在第二輪PCR使用；(5)最終產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。本檢測(cè)技術(shù)對(duì)家蠶微孢子蟲的檢測(cè)具有有效性強(qiáng)、特異性高、靈敏性高等特點(diǎn)，并且適用于小量樣品操作，操作流程巧妙。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103088129SQ20131001093
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者許金山, 周澤揚(yáng), 潘國(guó)慶, 王林玲, 李治, 黨曉群 申請(qǐng)人:重慶師范大學(xué)