一組微孢子蟲分子通用檢測(cè)引物及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組微孢子蟲通用檢測(cè)引物及其試劑盒。所述通用檢測(cè)引物包括上游引物HMG1F和下游引物HMG1R，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。該檢測(cè)引物以基因 HMG1 為靶基因，能夠同時(shí)應(yīng)用于多種微孢子蟲的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可靠、易于操作、靈敏度高，尤其是對(duì)于實(shí)際檢疫工作中，對(duì)于樣品的各種微孢子蟲的早期檢測(cè)，具有非常重要的實(shí)際應(yīng)用意義。
【專利說明】一組微孢子蟲分子通用檢測(cè)弓I物及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于昆蟲病原微生物分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一組微孢子蟲分子通用檢測(cè)引物及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]蠶微粒子病的研宄始于1845年發(fā)生在法國(guó)的全國(guó)流行微粒子病，巴斯德確定他觀察到的“微?！笔俏⒘Ｗ硬〉某梢蛞蛩?，其病原包括家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲等微孢子蟲病原物。尤其是家蠶微孢子蟲有水平傳播和垂直傳播兩種傳染途徑，其中垂直傳播對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)中的蠶種生產(chǎn)造成巨大的危害，同時(shí)對(duì)絲繭育蠶繭產(chǎn)量和品質(zhì)帶來很大的負(fù)面影響，嚴(yán)重影響蠶絲產(chǎn)業(yè)鏈下游經(jīng)濟(jì)的發(fā)展(蔡順風(fēng)等，2011)。自法國(guó)全國(guó)微粒子病爆發(fā)以來，家蠶微孢子蟲始終是各國(guó)蠶種生產(chǎn)和進(jìn)出口貿(mào)易的重要檢測(cè)對(duì)象。19世紀(jì)末，在日本養(yǎng)蠶業(yè)最發(fā)達(dá)的時(shí)期，《母蛾鏡檢法》、《蠶病預(yù)防法》曾被寫入憲法(Takeshi Kawarabata,2003)，我國(guó)也將其列為進(jìn)出口動(dòng)物檢疫二類疫病[《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》，(1992)農(nóng)(檢疫)字第12號(hào)]。
[0003]最初人們判別微孢子蟲主要根據(jù)微粒子病的發(fā)病特點(diǎn)進(jìn)行肉眼觀察。顯微鏡發(fā)明以后，人們根據(jù)微孢子蟲的形態(tài)和大小進(jìn)行顯微鏡鏡檢，一定程度上提高了檢測(cè)的靈敏度和效率，并因此遏制了法國(guó)全國(guó)流行的微粒子病。但是顯微鏡鏡檢有明顯的缺點(diǎn)，如對(duì)操作人員的技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)要求較高，而且微孢子蟲個(gè)體及其微小，常用的顯微鏡鏡檢檢測(cè)方法特異性和靈敏度較低，難以區(qū)分微孢子蟲類似物。
[0004]隨著PCR技術(shù)的普及，人們開始使用PCR方法來檢測(cè)微孢子蟲并且達(dá)到了較高的靈敏度。“分子鐘”是分子水平分析生物系統(tǒng)進(jìn)化中的有效手段，SSU rRNA (16S rDNA)是微生物進(jìn)化研宄中常用的“分子鐘”(Pei A Y, et al.，2010)。家蠶微粒子病PCR檢測(cè)技術(shù)研宄中所設(shè)計(jì)的引物針對(duì)的靶基因多數(shù)也是SSU rRNA，針對(duì)其他微孢子蟲基因設(shè)計(jì)的引物較少或靈敏度較差，因而很少被報(bào)道。Baker et al (1995)和Terry et al (1999)根據(jù)相近種屬微孢子蟲SSU rRNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)的PCR引物Vlf/530r，可鑒別多種種屬的微孢子蟲的DNA模板擴(kuò)增約450bp的特異目的條帶，但是靈敏性卻差強(qiáng)人意，而且本發(fā)明人研宄發(fā)現(xiàn)，使用該引物檢測(cè)蠶卵微孢子蟲時(shí)，檢測(cè)的靈敏度極低，暗示蠶卵抽提物中可能存在某種抑制因素干擾了對(duì)家蠶微孢子蟲(N.b) DNA的PCR擴(kuò)增。
[0005]而在實(shí)際工作中，尤其是檢疫工作，對(duì)于樣品的各種微孢子蟲病原的檢測(cè)是很重要的，且不能出現(xiàn)漏檢的情況，因此尋求一種既能夠通用的檢測(cè)多種微孢子蟲，又具有很好的檢測(cè)靈敏性，且以蠶卵DNA為模板時(shí)也具有很好的靈敏性的引物組，在微孢子蟲的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有微孢子蟲通用檢測(cè)技術(shù)的不足，以家蠶微孢子蟲基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)檢測(cè)引物，提供一種結(jié)果可靠、易于操作(簡(jiǎn)單快速)、靈敏度高的通用檢測(cè)多種微孢子蟲的方法。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種微孢子蟲分子通用檢測(cè)引物。
[0008]本發(fā)明另一目的是提供所述微孢子蟲分子通用檢測(cè)引物在制備微孢子蟲通用檢測(cè)試劑盒方面的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的再一目的是提供一種微孢子蟲通用檢測(cè)試劑盒。
[0010]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一組微孢子蟲通用檢測(cè)引物，所述通用檢測(cè)引物包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。
[0011]本發(fā)明在獲得了家蠶微孢子蟲邏基因的基礎(chǔ)上(邏基因DNA全長(zhǎng)核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)，以邏基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)了上述引物，該引物既能夠通用的檢測(cè)多種微孢子蟲，又具有很好的檢測(cè)靈敏性，在微孢子蟲的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和意義。所述引物尤其適用于同時(shí)檢測(cè)家蠶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲和玉米螟微孢子蟲。
[0012]本發(fā)明還提供了所述微孢子蟲通用檢測(cè)引物在制備微孢子蟲通用檢測(cè)試劑盒方面的應(yīng)用。提供了一種微孢子蟲通用檢測(cè)試劑盒，包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如SEQID N0.4 所示。
[0013]優(yōu)選地，所述試劑盒的使用方法如下:
以樣品DNA或cDNA為模板，利用引物HMGlF和HMGlR進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的大小判定結(jié)果；所述判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)為:瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)特異性地561bp的DNA片段產(chǎn)物，即該樣品感染了家蠶微孢子蟲。
[0014]優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為:
2 X反應(yīng)緩沖液1yL
10 μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L
10 μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L
模板DNAI μ L
ddH20補(bǔ)至 20 μ L ;
其中，2Χ反應(yīng)緩沖液的組分為Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0015]優(yōu)選地，所述PCR 反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5 min ；94°C 30 s，58.5°C 45 s，72°C45 8，32個(gè)循環(huán)；72°〇 10 min。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明公開了一組微孢子蟲通用檢測(cè)引物，是根據(jù)家蠶微孢子蟲(廣東株基因序列設(shè)計(jì)的引物，該引物可用于微孢子蟲病的PCR檢測(cè)，具有很好的通用性和靈敏性，既能夠通用的檢測(cè)多種微孢子蟲，又具有很好的檢測(cè)靈敏性，在微孢子蟲的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和意義。
[0017]另外，本發(fā)明引物及相關(guān)試劑可組裝成試劑盒，使用方便，而且PCR擴(kuò)增的模板不受限制，適用范圍廣，可以是樣品的DNA或cDNA，可以直接以蠶卵DNA為模板，大大增加了檢測(cè)對(duì)象的范圍。
[0018]重要的是，本發(fā)明的檢測(cè)引物和試劑盒能夠在微孢子蟲侵染的早期就能夠檢測(cè)出來，為微孢子蟲病的早期檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單快速的方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為HMGIF/ HMGlR引物的檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ;1:有毒蠶卵DNA，2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0020]圖2為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蠶卵DNA, 2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0021]圖3為HMGl-xF/ HMGl-xR引物的檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1:有毒蠶卵DNA, 2:純化的家蠶微孢子蟲(N.b) DNA, 3:(正常)無毒蠶卵DNA，4:ddH20。
[0022]圖4為HMGIF/ HMGlR引物的特異性檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對(duì)照。
[0023]圖5為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的特異性檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對(duì)照。
[0024]圖6為HMGl-xF/ HMG1-xR引物的特異性檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1:N.b (家蠶微孢子蟲)DNA ；2:N.a (柞蠶微孢子蟲)DNA ；3:N.f (玉米螟微孢子蟲)DNA ；4:水對(duì)照。
[0025]圖7為HMGIF/ HMGlR引物的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ； 1-7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對(duì)照。
[0026]圖8為HMGl-sF/ HMGl-sR引物的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1~7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對(duì)照。
[0027]圖9為HMGl-xF/ HMG1-xR引物的靈敏性檢測(cè)結(jié)果；泳道:M:DL1000 ；1~7分別為5.0XlO0、5.0X1'5.0X10_2、5.0X10_3、5.0X10_4、5.0X10_5、5.0X10_6 ng/μ L 的 N.bDNA，8為水對(duì)照。
[0028]圖10為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染四齡蠶不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:6h ；2:12h ；3:18h ；4:24h ；5:36h ；6:48h ；7:60h ；8:72h ；9:84h ；10:96h ；11:108h ；12:純化的 N.b cDNA ；13:正常家蠶中腸 cDNA ； 14:ddH20。
[0029]圖11為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染蠶卵(浸酸前)不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:2h ；2:8h ；3:10h ；4:12h ；5:17h ；6:純化的 N.b 孢子的 cDNA ；7:正常家蠶蠶卵cDNA ；8:ddH2Oo
[0030]圖12為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染蠶卵(不浸酸)不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；
9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。
[0031]圖13為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染蠶卵(浸酸)不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。

【具體實(shí)施方式】
[0032]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0033]除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。
[0034]實(shí)施例1家蠶微孢子蟲HMG 7基因
1、根據(jù)分子生物學(xué)的基因克隆技術(shù)中基因同源克隆的方法，克隆獲得了家蠶微孢子蟲HMG 2基因的cDNA和DNA全長(zhǎng)序列。
[0035]2、cDNA全長(zhǎng)的獲得，具體方法如下:
(I)運(yùn)用Primer premier 5.0軟件，結(jié)合綜合分析，設(shè)計(jì)了引物引物HMGIF/ HMG1R，序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0036]上游引物HMGlF (SEQ ID N0.3):
5’ ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3’
下游引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5’ TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3’。
[0037](2)以純化的家蠶微孢子蟲(N.b)孢子DNA為模板，以引物HMGIF/ HMGlR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0038](3)PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化，連接到pMD19T中，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH- 5α中培養(yǎng)。
[0039](4)提取重組質(zhì)粒，并測(cè)序，獲得邏基因的cDNA全長(zhǎng)，如SEQ ID N0.2所示。
[0040]3、DNA全長(zhǎng)的獲得
利用基因組高通量測(cè)序的方法，并經(jīng)過大量的基因預(yù)測(cè)對(duì)比分析，最后經(jīng)PCR測(cè)序驗(yàn)證，獲得了家蠶微孢子蟲HMG 2基因的DNA全長(zhǎng)序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0041]4、根據(jù)測(cè)序結(jié)果的多次確認(rèn)，得出家蠶微孢子蟲M 2基因的DNA全長(zhǎng)序列，如SEQ ID N0.1所示，其cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0042]實(shí)施例2檢測(cè)引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增方法的建立
1、引物設(shè)計(jì)
在獲得家蠶微孢子蟲/3私7基因的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，通過大量的抗藥性、特異性和靈敏性檢測(cè)，最終選取了 3對(duì)引物有代表性的引物組，各組引物序列如下:
(I)第一對(duì):
上游引物 HMGlF (SEQ ID N0.3):
5’ ATGACTGCTCAAAAAGACGATAC 3’
下游引物 HMGlR (SEQ ID N0.4):
5’ TTATTCATCACTATCTCCTACTTCT 3’。
[0043](2)第二對(duì):
上游引物 HMGl-sF (SEQ ID N0.5):
TTCCGAAATAATCTTCTTTTAATTG
下游引物 HMGl-sR (SEQ ID N0.6):
TTGTGCACCGAATCGTAAATAG (3)第三對(duì):
上游引物 HMGl-xF (SEQ ID N0.7):
TCCCTAGGAACTTTTAAAGAGAAG
下游引物 HMGl-xR (SEQ ID N0.8):
TCCTTTTATTCATCACTATCTCCT
2、PCR擴(kuò)增方法的建立
(I)以家香或家香香卵的總DNA的提取為例，說明樣品的DNA提取:
(方法只做參考，不具任何限定意義，通過本領(lǐng)域任何方法提取樣品DNA均可)
采用QIAGEN公司生產(chǎn)的植物DNA小提試劑盒(DNeasy Plant mini kit試劑盒)抽提蠶卵基因組DNA，步驟如下(按照說明書進(jìn)行):
取20粒蠶卵放入研缽中，液氮充分研磨，將研磨后的粉末收集至1.5mL的離心管中。加Λ 400 μ L裂解緩沖液APl和4 uL Rnase Α，渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ LRnase A勿在使用前混合)；混勻后的溶液，65°C，孵育10 min (期間上下顛倒試管2~3次)；加130 μ L緩沖液ΑΡ2，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，離心5 min ;吸取上清于過濾柱(QIAshredder spin column)中的收集管，14，OOOrpm，離心2min ;將離心管中上清液移至新管(勿攪動(dòng)出現(xiàn)的殘?jiān)?，加入1.5倍體積的AP3/E，移液器混合；將650 yL混合液移至吸附柱(DNeasy Mini spin column)中，4200 rpm，離心I min ;剩下的液體重復(fù)此步驟；將吸附柱放入新收集管中，加入500 μ L緩沖液AW，4200 rpm,離心I min ;棄上清；再加入500μ L緩沖液AW，14000 rpm，離心2 min(保證收集管不接觸到底部上清);移收集管至1.5 mL或2 mL離心管中；加入40 μ L緩沖液AE洗脫，室溫放置5 min ；4200 rpm離心I min ;重復(fù)上一步(即加入40 μ L緩沖液AE洗脫，室溫放置5 min, 4200 rpm離心I min);將提取好的總DNA置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0044](2) PCR擴(kuò)增方法
以樣品總DNA為模板，用實(shí)施例1所述三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0045]所述PCR反應(yīng)體系(總體積20 μ L):
2 X Taq Master Mix (反應(yīng)緩沖液)1yL
10 μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L
10 μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L
模板 DNAI μ L ；
ddH20補(bǔ)至 20 yLo
[0046]其中，2XTaq Master Mix (反應(yīng)緩沖液)的組分為Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl,40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μΜ dNTP。
[0047]PCR 反應(yīng)條件為:94°C 5 min ；94°C 30 s，58.5°C 45 s，72°C 45 s，32 個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。
[0048](3)結(jié)果判斷
第一對(duì)引物HMG1F/HMG1R:PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到561bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出561 bp的DNA片段產(chǎn)物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0049]第二對(duì)引物HMGl-sF/HMGl-sR:PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到684 bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出684bp的DNA片段產(chǎn)物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0050]第三對(duì)引物HMGl-xF/HMGl-xR:PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是否擴(kuò)增到251 bp的DNA片段判定蠶卵樣品是否感染了家蠶微孢子蟲。當(dāng)能特異性地?cái)U(kuò)增出251bp的DNA片段產(chǎn)物，即可判斷該家蠶或蠶卵感染了家蠶微孢子蟲。
[0051](4)分別取50?！坝卸尽毙Q卵(即感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵)、健康蠶卵和純化的家蠶微孢子蟲樣本，分別提取DNA，按照上述的PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0052]瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果分別如附圖1~3所示，三對(duì)引物均可在“有毒”蠶卵和純化的家蠶微孢子蟲中檢出特異性的DNA片段，而健康蠶卵中未檢測(cè)出特異性片段。表明三對(duì)引物和建立的PCR方法均可以很好的用于家蠶微孢子蟲的快速檢測(cè)。
[0053]實(shí)施例3引物特異性檢測(cè)
1、分別以家蠶微孢子蟲(N.b )、柞蠶微孢子蟲(N.a )、玉米螟微孢子蟲(N.f )的DNA為模板，以引物 HMGIF/ HMG1R，HMG1-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR，以實(shí)施例 2 的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
[0054]2、三對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖4~6所示。結(jié)果顯示，引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-xF/ HMGl-xR均能夠檢測(cè)到多種微孢子蟲，具有很好的通用檢測(cè)性。而引物HMG1-sF/ HMGl-sR只能特異的檢測(cè)家蠶微孢子蟲。
[0055]實(shí)施例4引物靈敏性檢測(cè)
1、提取家蠶微孢子蟲(N.b)的DNA，原始濃度為5.0 ng/ μ L。
[0056]將上述N.b DNA用ddH20進(jìn)行稀釋，分別稀釋10°、1iUO2UO3UO4UO'16倍。即得到濃度梯度為 5.0Χ10'5.ΟΧΙΟ'5.0Χ10_2、5.0Χ10_3、5.0Χ10_4、5.0Χ10_5、5.0X10—6ng/ μ L0
[0057]2、以上述各濃度的 N.b DNA 為模板，以引物 HMGIF/ HMG1R, HMGl-sF/ HMGl-sR，HMG1-xF/ HMGl-xR,以實(shí)施例2的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果O
[0058]3、三對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果分別如附圖7~9所示。結(jié)果顯示，引物HMGIF/ HMGlR和引物HMGl-sF/ HMGl-sR均能檢測(cè)到5.0X 10_4 ng/ μ L濃度的N.b DNA,具有很好的檢測(cè)靈敏性。而引物HMGl-xF/ HMGl-xR的靈敏性差了 I個(gè)數(shù)量級(jí)，能檢測(cè)到5.0X 10_3 ng/μ L濃度的 N.b DNAo
[0059]因此，綜上所述，從特異性和靈敏性的角度考慮，只有引物HMGIF/ HMGlR既能夠通用的檢測(cè)多種微孢子蟲，又具有很好的檢測(cè)靈敏性，在微孢子蟲的實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和意義。
[0060]以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)引物HMGIF/ HMGlR的檢測(cè)適用性和靈敏性進(jìn)行測(cè)試。
[0061]實(shí)施例5感染N.b不同時(shí)間段的四齡家蠶中腸和感染N.b的蠶卵檢測(cè) 1、總RNA的提取
使用按照艾德萊生物公司的EASYspin植物RNA快速提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別提取感染N.b不同時(shí)間段的四齡家蠶中腸和感染N.b的蠶卵的RNA，具體步驟如下:
Cl)取500 μ L裂解液RLT，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入50 μ L植物RNA助提劑(PLANTaid，結(jié)合有多糖多酚)混勻備用； (2 )液氮中研磨家蠶組織成細(xì)粉后，取50 mg細(xì)粉轉(zhuǎn)入上述裝有裂解液RLT和PLANTaid的離心管，立即用手劇烈振蕩20 S，充分裂解；
(3)將裂解物13000rpm離心5~10min，沉淀不能裂解的碎片和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid；
(4)取裂解物上清轉(zhuǎn)到一個(gè)新的離心管。加入上清體積一半的無水乙醇，此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心；
(5)將混合物(每次小于720μ L，多可以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13000 rpm離心2 min，棄掉廢液；
(6)加700μ L去蛋白液RWl，室溫放置Imin，13000rpm離心30s，棄掉廢液；
(7)加入500μ L漂洗液Rff, 13000 rpm離心30s，棄掉廢液。加入500 μ L漂洗液Rw,重復(fù)一遍；
(8)將吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；
(9)取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30~50 μ L去除RNA酶的無菌水(RNase free water，事先在70~90°C水浴中加熱，可提高產(chǎn)量)，室溫放置lmin，12000rpm離心lmin。
[0062]2、RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA
將提取到的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用TAKARA公司生產(chǎn)的PrimeScript ? RT reagentKit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒，步驟如下:
(I)去除基因組DNA反應(yīng)反應(yīng)體系(20 yL):
5 X gDNA Eraser Buffer4.0 μ L
gDNA Eraserl.0yL
總 RNA^ 2.0yg
RNase Free dH20加至 20 μ L
去除基因組DNA反應(yīng)條件:42°C，2min (或室溫5min最多可處理30min)。
[0063](2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄體系(40 μ L)
步驟(I)的反應(yīng)液20 μ L
5XPrimeScript Buffer24.0 μ L
PrimeScript RT Enzyme Mix I2.0 μ L
RT Primer Mix2.0 μ L
RNase Free dH20加至 40 μ L
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37°C，15min ;85°C，5s ；4°C /_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0064]3、PCR 檢測(cè)
以步驟2得到的各cDNA為模板，用特異性引物HMG1F/HMGR進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
[0065]反應(yīng)結(jié)果如附圖10所示，在N.b感染家蠶中腸的前12 h都沒有檢測(cè)到基因，說明此時(shí)微孢子蟲還沒有開始繁殖，而從18h開始基因有轉(zhuǎn)錄活性，此時(shí)微孢子蟲可能已經(jīng)開始進(jìn)行分裂繁殖。而這一結(jié)論與現(xiàn)有技術(shù)中家蠶微孢子蟲侵染家蠶的生活史是一致的，也從側(cè)面證實(shí)了本發(fā)明所述檢測(cè)引物具有很好的特異性和敏感性。
[0066]實(shí)施例6 N.b感染蠶卵不同時(shí)間cDNA模板的檢測(cè)
1、本實(shí)施例分別以N.b感染蠶卵和正常家蠶蠶卵為檢測(cè)對(duì)象，分別以不浸酸、浸酸前、浸酸后的N.b感染后不同時(shí)間的蠶卵的cDNA為模板，以正常家蠶蠶卵DNA為對(duì)照，以HMGIF/ HMGlR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0067]2、實(shí)驗(yàn)方法
(I)浸酸前取樣:家蠶微孢子蟲感染家蠶后，在蠶蛾交配2h、8h、10h、12h、17h時(shí)分別取蠶卵，置于-80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0068](2)浸酸處理:將一個(gè)卵圈平均分成兩份，產(chǎn)卵后20h左右，浸酸(鹽酸比重為1.075)，浸酸條件為:46°C浸酸5min，清水沖洗20min，置于溫度為25°C，濕度為85%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至蟻蠶。
[0069](3)將浸酸與不浸酸的蠶卵按產(chǎn)卵后 24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h (蟻蠶)取樣，置于_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0070]3、結(jié)果如附圖11~13所示。
[0071]圖11為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染蠶卵(浸酸前)不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:2h ；2:8h ；3:10h ；4:12h ；5:17h ；6:純化的 N.b 孢子的 cDNA ；7:正常家蠶蠶卵cDNA ；8:ddH20o
[0072]圖12為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染蠶卵(不浸酸)不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；
9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。
[0073]圖13為HMGIF/ HMGlR引物對(duì)N.b感染蠶卵(浸酸)不同時(shí)間cDNA模板的PCR結(jié)果；泳道:M 為 DL1000 ；1:24h ；2:48h ；3:72h ；4:96h ；5:120h ；6:144h ；7:168h ；8:192h ；9:216h ；10:240h ；11:純化的 N.b 的 cDNA ；12:正常家蠶蠶卵 cDNA ；13:ddH20。
[0074]附圖11~13的檢測(cè)結(jié)果表明，在蠶卵產(chǎn)下2 h時(shí)，即可檢測(cè)到M2基因有轉(zhuǎn)錄活性，而且在此后蠶卵(浸酸與不浸酸)的整個(gè)發(fā)育過程基因都有轉(zhuǎn)錄活性，因此可以將
基因作為一個(gè)分子靶標(biāo)，來檢測(cè)早期蠶卵是否感染了家蠶微孢子蟲。
[0075]綜上所述，本發(fā)明的檢測(cè)引物和試劑盒能夠準(zhǔn)確地判斷樣品是否含有家蠶微孢子蟲，尤其是檢測(cè)蠶卵家蠶微孢子蟲，為蠶種生產(chǎn)中“有毒”蠶種的檢測(cè)及安全發(fā)種提供了保證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，細(xì)似基因是一個(gè)很好的檢測(cè)微孢子蟲的分子靶標(biāo)。
【權(quán)利要求】
1.一組微孢子蟲通用檢測(cè)引物，其特征在于，所述通用檢測(cè)引物包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
2.權(quán)利要求1所述微孢子蟲分子通用檢測(cè)引物在制備微孢子蟲通用檢測(cè)試劑盒方面的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述微孢子蟲為家蠶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲或玉米螟微孢子蟲。
4.一種微孢子蟲通用檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括上游引物HMGlF和下游引物HMG1R，上游引物HMGlF的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物HMGlR的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下: 以樣品DNA或cDNA為模板，利用引物HMGlF和HMGlR進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)擴(kuò)增DNA片段的大小判定結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為: 2 X反應(yīng)緩沖液1yL 10 μ M 上游引物 HMGlF0.5 μ L 10 μ M 下游引物 HMGlR0.5 μ L 模板DNAI μ L ddH20補(bǔ)至 20 μ L ; 其中，2Χ反應(yīng)緩沖液的組分為Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0mM MgCl2,400 μ M dNTP。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?94°C5min -M0C 30 s,58.5°C 45 s,72°C 45 s，32 個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)為:瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)特異性地561 bp的DNA片段產(chǎn)物，即該樣品感染了家蠶微孢子蟲。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104498599SQ201410755669
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】劉吉平, 宋小景, 程偉 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)