用于改善仔豬腸道營養(yǎng)的結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于仔豬免疫調(diào)節(jié)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以谷朊粉為原料，通過多酶水解，制備能顯著改善仔豬腸道營養(yǎng)的結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道是動物消化吸收養(yǎng)分的主要場所。仔豬尤其是斷奶仔豬的腸道發(fā)育還很不完善，對外部因素的變化比較敏感，斷奶帶來的巨大應(yīng)激及飼料形態(tài)的改變使腸黏膜破壞，造成養(yǎng)分的消化吸收率降低，免疫功能下降，影響了仔豬的生長發(fā)育，進而影響以后整個生長階段的健康和發(fā)育。因此，改善仔豬的腸道營養(yǎng)具有重要意義。
[0003]谷氨酰胺是人體和動物機體的必需氨基酸。大量研宄表明，它不僅是機體中氨基的主要儲存形式，同時也具有一系列生理活性和營養(yǎng)功能，主要表現(xiàn)為:一是機體細(xì)胞合成核苷酸的前體物，是快速增值細(xì)胞(尤其是淋巴細(xì)胞和腸粘膜細(xì)胞)的主要能源物質(zhì)，可提高機體的免疫功能，促進小腸絨毛膜的生長；二是參與合成還原態(tài)谷胱甘肽，提高機體的抗氧化能力，保護腸道免受毒素?fù)p害和過氧化損傷，減少疾病和環(huán)境應(yīng)激條件對機體的損害，保證機體的正常代謝；三是促進蛋白質(zhì)(尤其是肌肉蛋白質(zhì))的合成，具有抗疲勞的效果。因此，谷氨酰胺不僅是重要的胃腸類藥物，也是運動員快速恢復(fù)體力的常用補充劑，在動物營養(yǎng)中也得到廣泛應(yīng)用。但游離的谷氨酰胺溶解性低、熱穩(wěn)定性差，在水溶液中容易轉(zhuǎn)化為谷氨酸或焦谷氨酸，大大降低其應(yīng)用效果。因此，人們更期待制備結(jié)合肽替代游離的谷氨酰胺。
[0004]研宄表明，結(jié)合態(tài)谷氨酰胺不僅具有游離谷氨酰胺的功能，而且小肽更容易被吸收，且利用率更高。目前所應(yīng)用的谷氨酰胺肽主要是丙氨酰-谷氨酰胺二肽和甘氨酰-谷氨酰胺二肽，但由于是人工合成，其價格昂貴，在生產(chǎn)實際中應(yīng)用經(jīng)濟成本較高。因此，以富含谷氨酰胺的蛋白質(zhì)為原料，通過酶解方法制備結(jié)合肽谷氨酰胺是經(jīng)濟、合理的技術(shù)選擇。
[0005]谷朊粉是將小麥面粉中的淀粉去除后的產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量高達80%。谷朊粉中的谷氨酰胺含量高達33%以上，是目前含谷氨酰胺最多的植物蛋白。通過酶解可以得到含有結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的生物肽，與人工合成的谷氨酰胺二肽相比，其價格優(yōu)勢非常明顯。
[0006]目前水解谷朊粉(小麥蛋白)的研宄文獻較多，獲得了具有不同功能性質(zhì)或特征的小麥蛋白酶解物，如潘麗軍“雙酶分步水解法制備谷氨酰胺活性肽的研宄”(食品工業(yè)科技，2008)，谷中華“小麥面筋蛋白酶解制備合適分子量小肽的研宄”(食品工業(yè)科技，2013)用了 4種蛋白酶，分別用單一蛋白酶直接對谷朊粉酶解考察不同酶的水解功效。楊得勝“水解面筋蛋白高效制備谷氨酰胺結(jié)合肽的研宄”(食品科學(xué)，2006)中采用2種蛋白酶的組合進行研宄。關(guān)于小麥蛋白酶解的學(xué)位論文也有若干篇，如呂艷“酶解小麥蛋白制取谷氨酞胺活性膚的研宄”(浙江大學(xué)，2008)用酸性蛋白酶水解；張海華“小麥面筋蛋白源谷氨酰胺肽的酶解制備，結(jié)構(gòu)分析與生理活性研宄”(江南大學(xué)，2011)中用堿性蛋白酶水解；孔祥珍“麥面筋蛋白的酶解及其阿片肽的研宄”(江南大學(xué)，2007)中分別單獨使用了多種蛋白酶進行研宄；洪瑾芳“酶解小麥蛋白對熱應(yīng)激小鼠生理功能的影響”(福建農(nóng)林大學(xué)，2009)用復(fù)合蛋白酶水解；張麗“谷氨酞胺活性肽的制備及性質(zhì)研宄”(合肥工業(yè)大學(xué)，2009)采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶；李清麗“谷朊粉活性肽的酶解制取工藝研宄”(河南工業(yè)大學(xué)，2007)采用胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶中的單酶水解和雙酶結(jié)合水解等。
[0007]有多篇專利文獻中也涉及到小麥蛋白的酶解。如新威公司的“一種飼用小麥水解蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)方法CN200910065614.7”采用堿性蛋白酶和復(fù)合酶兩步水解法；春發(fā)公司“一種谷朊粉水解液的制備方法CN201110216644.0”采用磷酸預(yù)處理加熱反應(yīng)2小時后再加堿液+木瓜酶、胰蛋白酶混合物，最后再用風(fēng)味酶水解；天九公司“從谷朊粉中酶法制取小麥肽的工業(yè)生產(chǎn)方法CN200810015396.1”采用復(fù)合酶水解反應(yīng)8小時；江南大學(xué)等“一種酶解小麥蛋白制備小麥蛋白源阿片活性肽的方法CN200910231736.9”采用胃蛋白酶反應(yīng)9?24小時，再加胰蛋白酶水解4?6小時，滅酶離心后上清液活性碳脫色，再超濾、干燥得產(chǎn)品。遠成藥業(yè)“一種谷朊粉肽的提取方法CN201010540566.5”在物料中加入乙醇和亞硫酸鈉并蒸煮數(shù)小時后，依次用堿性酶和風(fēng)味酶水解，再脫色、脫鹽、濃縮、干燥得到谷朊粉肽；聯(lián)海公司“一種小麥水解蛋白的生產(chǎn)方法CN201310191254.1”采用物料先用復(fù)合酶水解后再用淀粉酶和糖化酶水解，最后接種酵母菌發(fā)酵。
[0008]上述研宄雖然是谷朊粉或小麥蛋白的酶解，但由于各種蛋白酶的水解特性和酶解順序不同，導(dǎo)致其酶解產(chǎn)物的性質(zhì)和功能也有很大差異。但鮮有以制備可改善仔豬腸道營養(yǎng)為主要研宄目標(biāo)的，僅見于劉文豪“麥谷蛋白源谷氨酰胺肽的制備和腸道營養(yǎng)效果研宄”(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)，但該文獻僅是將小麥谷朊粉中的醇溶蛋白去除后，用其中的麥谷蛋白為原料，再用胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解，與本發(fā)明采用谷朊粉為原料，通過淀粉酶和蛋白酶的順序水解方法有根本性不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]鑒于谷氨酰胺對動物生長發(fā)育具有重要影響、游離谷氨酰胺不穩(wěn)定、合成谷氨酰胺二肽成本高、不適宜大量應(yīng)用等特點，本發(fā)明提供一種結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的制備方法，以富含谷氨酰胺的小麥谷朊粉為原料，采用淀粉酶和蛋白酶順序水解的方法，制備對仔豬小腸絨毛膜發(fā)育有顯著效果的結(jié)合態(tài)谷氨酰胺。
[0010]為解決上述問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
先用淀粉酶將谷朊粉中的淀粉水解為適宜大小的糊精，使其有利于參與后續(xù)蛋白酶水解過程中功能性產(chǎn)物的生成。在前述淀粉酶處理的基礎(chǔ)上，按照一定的順序，先后使用不同的蛋白酶定向水解谷朊粉蛋白中的不同位點，將其降解為具有特定功能的小肽分子。具體包括以下步驟:
(1)取谷朊粉與65?75°C水按1:2?5的重量比混合，15?50分鐘后，再按當(dāng)前物料總重的0.1?0.3wt%加入淀粉酶，反應(yīng)0.5?2.0小時后，將該物料降溫到50?55°C，用堿液調(diào)整pH至8.0?10.0，再按物料的0.2?1.2被％加入堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合酶，二者重量比為1:1，然后保溫反應(yīng)1.0?2.5小時；再按照上步所得物料總重的0.2?1.0被％加入復(fù)合蛋白酶，攪拌條件下反應(yīng)1.0?2.5小時；將上步所得物料溫度調(diào)整為35?38°C，用堿液調(diào)整pH至7.5?8.0，按照當(dāng)前物料總重的0.05?0.3wt%加入胰蛋白酶，攪拌反應(yīng)2.0?3.5小時；
(2)用酸調(diào)節(jié)上步所得物料pH至4.3?4.8，加熱到100°C滅酶15?20分鐘，2500?3500轉(zhuǎn)/min離心除去沉淀物；
(3)將上步所得離心上清液用微濾膜超濾，然后經(jīng)過濃縮、壓力噴霧干燥，得到含有結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的粉狀物。
[0011]所述淀粉酶優(yōu)選為中溫α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶中的至少一種。
[0012]所用堿液優(yōu)選為0.5?2.0 mo I/L的氫氧化鈉溶液。
[0013]所用酸優(yōu)選為0.5?2.0mol/L的鹽酸。
[0014]所述微濾膜的優(yōu)選孔徑為0.45微米。
[0015]本發(fā)明的積極有益效果:
本發(fā)明在大量研宄的基礎(chǔ)上，確定先用淀粉酶處理后，再按照特定的順序，用四種來源于動植物和微生物的蛋白酶依次水解谷朊粉，經(jīng)酸化沉淀、膜分離技術(shù)處理等制備結(jié)合態(tài)谷氨酰胺。經(jīng)動物試驗證明，該結(jié)合態(tài)谷氨酰胺具有改善仔豬腸道營養(yǎng)、促進仔豬小腸絨毛膜生長發(fā)育、提高仔豬抗應(yīng)激能力等效果。
[0016](I)本發(fā)明首先使用淀粉酶將谷朊粉中的淀粉大分子降解為小分子的糊精或還原糖，減少淀粉與蛋白質(zhì)的相互作用，然后，按照特定順序依次使用不同的蛋白酶水解物料中的蛋白質(zhì)。
[0017](2)本發(fā)明將反應(yīng)料液調(diào)整到特定pH范圍再加熱，這不僅有利于快速滅酶，還可使輕度水解的大分子蛋白質(zhì)沉淀，更有利于小分子肽的分離。
[0018](3)經(jīng)分析本發(fā)明所得產(chǎn)物中90%以上是分子量小于2000 Da的成分，結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的含量大于29.1%，游離谷氨酰胺的含量小于0.3%。經(jīng)動物飼喂試驗，該產(chǎn)物對改善仔豬腸道營養(yǎng)、促進其小腸絨毛膜生長發(fā)育有顯著效果。
[0019](4)本發(fā)明所用原料來源廣，且具有易操作、產(chǎn)物活性高、市場前景廣闊等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0020]圖1為本發(fā)明實施方法I所得產(chǎn)物的分子量圖譜(凝膠色譜柱分析)；
圖2為本發(fā)明實施方法2所得產(chǎn)物的分子量圖譜(凝膠色譜柱分析)；
圖3為本發(fā)明實施方法3所得產(chǎn)物的分子量圖譜(