轉(zhuǎn)基因苜蓿草j101品系特異性環(huán)介導等溫擴增檢測用引物及檢測方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測用引物及檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002]轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系由孟山都公司開發(fā)的耐除草劑的轉(zhuǎn)基因品系，2005年美國和加拿大批準環(huán)境釋放和作為飼料應用，目前還未獲得我國轉(zhuǎn)基因生物安全證書，尚未批準其進口。
[0003]轉(zhuǎn)基因苜蓿通過飼料進入動物養(yǎng)殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉(zhuǎn)基因食品，可能對于人的健康產(chǎn)生影響。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全評價管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》，凡是在中國境內(nèi)銷售的轉(zhuǎn)基因生物，必須進行標識。對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識需要檢測方法的支撐。目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品基于核酸基礎上的檢測可以分為4種檢測策略:1)篩查法:對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的啟動子中的啟動子、終止子等通用基因進行篩查；2)基因特異性檢測:對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源目的基因進行檢測；3)構(gòu)建特異性檢測:對外源目的基因與啟動子或終止子的特異連接序列進行檢測；4)品系特異性/轉(zhuǎn)化事件特異性檢測:對外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進行檢測。
[0004]由于啟動子、終止子、目的基因可以有多種組合關系，同一組合轉(zhuǎn)化同一植物也可產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)化事件，特別對于進境監(jiān)管，同一種作物有些轉(zhuǎn)基因品系是允許進口，而有些品系可能由于某種原因沒有區(qū)得準入。因此篩查法、基因特異性檢測和構(gòu)建特異性檢測具有局限性，不能完全滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品身份驗證等檢測、監(jiān)測和安全管理的需求。而品系特異性/轉(zhuǎn)化事件是指某個外源基因表達框(或片段)插入到宿主基因組某個位置而形成的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。因此轉(zhuǎn)化事件一旦發(fā)生就具有唯一性，針對轉(zhuǎn)化事件的檢測可以起到身份識別的作用。。
[0005]2000 年，Notomi 等開發(fā)了環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermalamplificat1n, LAMP)，其原理是針對目的核酸片段的設計特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在約62°C進行等溫擴增。該方法具有靈敏度高，特異性好，反應時間短，判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢。但是，針對不同的檢測對象，引物的篩選以及針對性的擴增和檢測條件是獲得高靈敏度、高特異性結(jié)果的關鍵，對于同一種檢測對象，采用不同的引物組合，其檢測結(jié)果也相差甚遠。目前未見到有轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl該作物品系特異性LAMP可視化檢測方法相關文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是針對現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因苜蓿草采用的篩查檢測技術不能準確地檢測具體的轉(zhuǎn)基因品系的不足，提供一組轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP檢測用引物，該組引物具有高特異性和靈敏度，基于所述引物及其組合，本發(fā)明可成功建立轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP可視化檢測方法。
[0007]本發(fā)明要解決的另一技術問題是提供轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP可視化檢測方法。
[0008]本發(fā)明還一要解決的技術問題是提供所述檢測方法的應用。
[0009]本發(fā)明的上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn):
[0010]本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實驗研宄總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系的
3‘端外源插入片段E9 3與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列信息的分析，設計得到一組共六條特異性的引物。并確定了精確地檢測步驟和條件，建立特異性強、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP可視化檢測方法，滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品身份驗證等檢測、監(jiān)測和安全管理的需求。
[0011]具體地，本發(fā)明提供一組轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP檢測用引物F3、B3、FIP、BIP、LF 和 LB，所述引物的序列分別如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示:
[0012]SEQ ID N0.1:F3:5’ -TTCCAGAATCCTTGTCAGATTC-3 ’。
[0013]SEQ ID N0.2: B3:5 ’ -GCTGGAATTAGCAAGATAAG-3 ’。
[0014]SEQ ID N0.3:FIP:5’-ATCGATGCGGCCACCACTGACTTGCCAATTGATTGACAAC-3’。
[0015]SEQ ID N0.4: BIP: 5’ -CCCATTTGGACGTGAATGTAGATTAATGCATACGATCCGTCG-3’。
[0016]SEQ ID N0.5: LF: 5 ’ -GGCTGCAGGTCGATTGAT-3 ’。
[0017]SEQ ID N0.6: LB: 5 ’ -CACGTCGAAATAAAGATTTCCG-3 ’。
[0018]本發(fā)明同時提供一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性實時熒光PCR檢測方法，包括以下步驟:
[0019]S1.提取DNA作為反應的模板；
[0020]S2.采用所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB進行LAMP可視化檢測，根據(jù)檢測結(jié)果進行判斷；
[0021]其中，S2步驟所述實時熒光PCR檢測反應體系為25 μ L: 10XThermopolbuffer2.5 μ L、F3 和 B3 各 0.5 μ L (10 μ Μ)、FIP 和 BIP 各 I μ L (40 μ Μ)、LF 和 LB 各0.5 μ L (40 μ Μ)、dNTPs 4 μ L (1mM)、MgSO4I μ L (10mM)、Bst DNA polymerase I μ L (8U/μ L)、Template DNAl μ L 和 11.5 μ L ddH20。
[0022]S2步驟所述檢測的反應程序為:63°C恒溫反應60min，85°C加熱2min使酶失活，反應即結(jié)束。
[0023]優(yōu)選地，S2步驟所述實時熒光PCR檢測反應體系中MgSO4濃度為2mM。
[0024]根據(jù)檢測結(jié)果進行判斷的方法可以采用以下兩種方法的其中之一:
[0025]方法一:根據(jù)顏色變化進行結(jié)果判斷:向反應終體系加入0.2 μ LSYBR green I，Imin觀察結(jié)果，陽性反應呈現(xiàn)黃綠色，而陰性的反應保持橙色；
[0026]方法二:電泳檢測判斷:根據(jù)LAMP法擴增的產(chǎn)物是各種不同長度的莖-環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA,因此陽性反應的產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖電泳檢測呈梯形條帶，而陰性反應則沒有梯形擴增條帶出現(xiàn)。
[0027]本發(fā)明同時提供了所述方法的應用，應用于鑒別轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系與其他作物。尤其是應用于與轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大米cry IA(a/b)、非轉(zhuǎn)基因油菜籽、非轉(zhuǎn)基因小麥、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿的檢測鑒別方面。
[0028]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0029]本發(fā)明根據(jù)苜蓿草終止子(E9 3)與內(nèi)源苜蓿草基因組DNA鄰接區(qū)序列，首次設計了 JlOl品系特異性的LAMP檢測用引物，外引物F3和B3覆蓋了鄰接區(qū)區(qū)域，可以實現(xiàn)對JlOl品系特異性鑒別。本發(fā)明篩選的設計和篩選的引物組，首次實現(xiàn)成功采用LAMP方法對JlOl進行品系特異性的鑒定。
[0030]本發(fā)明還對啟動子與苜蓿草基因組DNA鄰接區(qū)序列采用LAMPdesigner進行引物設計嘗試，無法獲得合適的LAMP反應的引物。
[0031]本發(fā)明首次提供了一組共6條引物，該組引物對鄰接區(qū)序列的6個特異序列區(qū)的識別，保證了本發(fā)明檢測方法LAMP擴增的高度特異性；本發(fā)明設計的環(huán)引物使得擴增效率進一步大大提尚，耗時短，在Ih內(nèi)可實現(xiàn)對JlOl品系的鑒定。
[0032]本發(fā)明的擴增體系均在等溫條件下采用特異性酶進行擴增，對實驗儀器要求低，檢測成本低；通過加入顯色染料，無需借助儀器，可通過肉眼快速觀察結(jié)果，利于現(xiàn)場的臨床樣品快速可視化檢測。
[0033]進一步地，本發(fā)明成功建立了苜蓿草JlOl品系特異性LAMP檢測體系，操作簡單、檢測結(jié)果準確。通過對苜蓿草JlOl等農(nóng)作物進行的特異性試驗表明，本發(fā)明建立LAMP方法僅對苜蓿草JlOl品系的檢測結(jié)果為陽性；檢測最低DNA濃度為(limit of detect1n，LOD)為16pg，相當于10拷貝轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl基因組DNA ;
[0034]本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP可視化檢測方法特異性好，靈敏度高，能夠快速、準確、穩(wěn)定地對轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl成分進行檢測分析。
【附圖說明】
[0035]圖1是轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系外源插入片段示意圖，A為擴增區(qū)域。
[0036]圖2轉(zhuǎn)基因苜蓿JlOl品系外源插入片段E9 3與內(nèi)源苜蓿草基因組DNA鄰接區(qū)LAMP引物的位置:下劃線部分為苜蓿草基因組DNA部分序列，加粗堿基為E9 3部分序列。
[0037]圖3是JlOl品系特異性LAMP特異性試驗結(jié)果(顏色判斷)，其中8為J101，I?6為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大米cryIA (a/b)、非轉(zhuǎn)基因油菜籽、非轉(zhuǎn)基因小麥、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿。
[0038]圖4是JlOl品系特異性LAMP特異性試驗結(jié)果(電泳)，其中8為J101，I?6為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大米cryIA(a/b)、非轉(zhuǎn)基因油菜籽、非轉(zhuǎn)基因小麥、非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿。
[0039]圖5是JlOl品系特異性LAMP靈敏度試驗結(jié)果(顏色)，2?8分別為16ng、1.6ng、0.16ng、0.08ng、0.016ng、0.008ng 和 0.0016ng 的 JlOl 基因組 DNA 模板。
[0040]圖6是JlOl品系特異性LAMP靈敏度試驗結(jié)果(電泳)，I?7分別為16ng、1.6ng、
0.16ng、0.08ng、0.016ng、0.008ng 和 0.0016ng 的 JlOl 基因組 DNA 模板。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明方法。下述實施例和附圖僅用于示例性說明，不能理解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的生物材料、試劑原料為常規(guī)市購或商業(yè)途徑獲得的生物材料和試劑原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規(guī)使用的方法和設備。
[0042]實施例1:設計引物與篩選及LAMP檢測體系成分
[0043]本發(fā)明通過創(chuàng)造性分析結(jié)合大量實驗研宄，基于轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系的3’端外源插入片段E9 3與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，見附圖1中A處所示。結(jié)合序列信息的分析，采用LAMPdesigner軟件進行設計，獲得一組特異性的LAMP引物，見附圖2 ;建立特異性強、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP檢測方法。
[0044]本發(fā)明嘗試采用JlOl品系基因組5’端Pe-FMV(啟動子)端與苜?；蚪MDNA鄰接區(qū)序列設計LAMP引物，經(jīng)生物信息學分析，無法得到合適的LAMP引物。
[0045]在利用E9 3端與苜?；蚪M序列設計時還得到另一組引物F3-2、B3-2、FIP(Flc+F2)-2、BIP(Blc+B2)-2、LoopF-2、LoopB-2，其序列分別如 SEQ ID N0.7, SEQ IDN0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.12 所示::
[0046]F3-2: CTCATGGATTTGTAGTTGAG
[0047]B3-2:GCTGGAATTAGCAAGATAAG
[0048]FIP(Flc+F2)-2:ATCGATGCGGCCACCACTGACTTGCCAATTGATTGACAAC
[0049]BIP(Blc+B2) _2:CCCATTTGGACGTGAATGTAGATTAATGCATACGATCCGTCG
[0050]LoopF-2:GGCTGCAGGTCGATTGAT
[0051]LoopB-2: CACGTCGAAATAAAGATTTCCG
[0052]因為外引物B3-2所在位置所不能覆蓋到E9 3與苜蓿草基因組DNA的鄰接區(qū)域，雖然可以進行LAMP擴增，但無法建立JlOl品系特異性LAMP擴增體系。反應的結(jié)果不能達到品系特異性鑒定的目的。
[0053]本發(fā)明確定的轉(zhuǎn)基因苜蓿草JlOl品系特異性LAMP檢測用引物F3、B3、FIP、BIP、LF和 LB