快速檢測柑橘全爪螨擬除蟲菊酯抗性的分子標記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種分子標記，尤其涉及一種快速檢測柑橘全爪螨擬除蟲菊酯抗性的分子標記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柑橘全爪螨是一種世界性害螨，對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，因其分布廣、危害重以及抗性發(fā)展迅速等特點受到廣泛關(guān)注。目前化學防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施。但是化學農(nóng)藥施用不當，不僅影響果品安全，同時還會導致嚴重的抗性藥。擬除蟲菊酯類藥劑是一類殺蟲(螨)效果好、毒性低和環(huán)境友好型農(nóng)藥，在害蟲防治中廣泛使用。然而，柑橘全爪螨對這類藥劑產(chǎn)生了較為嚴重的抗藥性，大大降低了這類殺蟲(螨)劑的防治效果。
[0003]昆蟲鈉離子通道是神經(jīng)細胞傳導興奮的基礎(chǔ)，同時，鈉離子通道基因還與昆蟲產(chǎn)生擊倒抗性有關(guān)。研宄表明，電壓門控鈉離子通道突變可以降低柑橘全爪螨對擬除蟲菊酯類藥劑的敏感性，從而介導抗性的產(chǎn)生。F1538I這一突變已在多種蜱、螨類害蟲中報道與擬除蟲菊酯類藥劑的抗性相關(guān)。研宄發(fā)現(xiàn)，在萬州柑橘全爪螨種群中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)F1538I的突變，且這種突變與其對擬除蟲菊酯抗性相關(guān)。但是目前還沒有一種快速有效的方法來診斷柑橘全爪螨對擬除蟲菊酯抗性的分子標記。且目前相關(guān)的分子診斷技術(shù)均需要先提取樣品的DNA，單頭螨提取DNA十分困難，這大大增加了操作的時間和復雜性。此外，目前還沒有針對柑橘全爪螨鈉離子通道基因抗性相關(guān)突變位點的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種不用事先單獨提取DNA、利用巢式PCR方法、以單頭柑橘全爪螨為樣品并結(jié)合雙酶切的快速檢測柑橘全爪螨擬除蟲菊酯抗性的分子標記方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種快速檢測柑橘全爪螨擬除蟲菊酯抗性的分子標記方法，包括如下步驟:
[0007]I)制備PCR擴增模板:以單頭柑橘全爪螨為樣品，分別將每個樣品放入PCR管中，加入3 μ L ddH20后研磨螨蟲體，將研磨好的樣品作為第一輪PCR擴增的模板；
[0008]2)進行巢式PCR擴增:
[0009]第一輪PCR:以3 μ L步驟I制備的樣品作為擴增模板，使用引物Α、B進行PCR擴增；
[0010]第二輪PCR:以第一輪PCR產(chǎn)物作為擴增模板，使用引物C、D進行PCR擴增；
[0011]所述引物A、B、C、D是根據(jù)柑橘全抓螨鈉離子通道基因(GenBank ID:KF646792.1)設(shè)計的，引物A、B、C、D的序列如下:
[0012]A:TATTATGGACCATGCGATTGA ；
[0013]B:CAAAGACGTTCCAAGGTTCTC ；
[0014]C:GTATTTTTTATCATTTTCGGCTCATTG ；
[0015]D:CCTGGTAGTGGTCAAGGGACAT ；
[0016]3)酶切:取步驟2中得到的第二輪PCR產(chǎn)物用BclI酶進行酶切反應(yīng)。
[0017]4)電泳:將步驟3中酶切后的反應(yīng)液用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察307bp和281bp處是否有條帶:如果只在307bp處有條帶，說明該螨在1538位點為純合子，基因型為TTC ;如果在307bp和281bp處均有條帶，說明該螨的基因型為雜合子，等位基因分別為TTC和ATC ;如果只在281bp處有條帶，則說明該螨的基因型為純合子，基因型為ATC。
[0018]所述步驟I中研磨螨蟲體的方法為:將10 μ L槍頭的槍頭口在火上燒成封閉的球狀，冷卻，用制備好的小槍頭研磨PCR管中的柑橘全爪螨直到?jīng)]有明顯的組織即可。
[0019]所述步驟2中第一輪PCR的反應(yīng)體系為:10 μ L 2 XPhire動物組織PCR緩沖液、I UL引物A、1 yL引物B、0.4 yL Phire熱啟動II DNA聚合酶、3 μ L步驟I制備的PCR擴增模板、用ddH20補充至20 μ L。反應(yīng)條件:98°C起始變性5min，98°C變性5s、58°C退火5s、72°C延伸20s、循環(huán)40次，最后72°C延伸Imin ；
[0020]第二輪PCR 的反應(yīng)體系為:PrimeSTAR Max premix (2 X) 12.5 μ L，引物 C IyLj物D I μ L、第一輪PCR產(chǎn)物I μ L、加ddH20補充至25 μ L ;反應(yīng)條件:98°C變性15s、60°C退火30s、循環(huán)35次，延伸5min。
[0021]所述步驟3中的酶切反應(yīng)方法為:取步驟2中得到的第二輪PCR產(chǎn)物15 μ L進行酶切，酶切體系:15yL PCR 產(chǎn)物、2 yL 1XFastDigest Green BufferU μ L BclI 酶、加水補充至30 μ L ;反應(yīng)條件:37°C反應(yīng)10min，65°C反應(yīng)5min。
[0022]本發(fā)明的技術(shù)原理是:已有研宄表明，對擬除蟲菊酯敏感的柑橘全爪螨種群中電壓門控鈉離子通道在1538位點對應(yīng)的氨基酸為F，由TTC編碼；而對擬除蟲菊酯具有抗性的柑橘全爪螨種群中在該位點對應(yīng)的氨基酸為I，由ATC編碼。因此，抗性種群中對應(yīng)的氨基酸是由TTC發(fā)生堿基顛換形成ATC，基于這一個位點的差異，通過引物C的設(shè)計形成一個限制性內(nèi)切酶BclI的識別位點TGATCA。進行巢式PCR，第一輪PCR旨在提高第二輪PCR的模板豐度和增加第二輪PCR產(chǎn)物的特異性。第一輪PCR直接以柑橘全爪螨整蟲為模板，引物分別為A和B，分別設(shè)計在F1538位點的上游和下游，擴增產(chǎn)物長為518bp ;第二輪PCR的引物設(shè)計在第一輪的產(chǎn)物內(nèi)，分別為引物C和D，第二輪的擴增產(chǎn)物為307bp。進行酶切后，如果只在307bp處有條帶，說明該螨在1538位點為純合子，基因型為TTC，沒有突變的存在。如果在307bp和281bp處均有條帶，說明該螨的基因型為雜合子，等位基因分別為TTC和ATCo如果只在281bp處有條帶，則說明該位點為突變后的純合子，為ATC。通過對1538位點基因型的檢測和分析，結(jié)合檢測樣品對擬除蟲菊酯的抗性表現(xiàn)，可以分析出該突變與柑橘全爪螨對擬除蟲菊酯抗性的相關(guān)程度。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:避免了 DNA提取這一步驟，直接利用巢式PCR和酶切的方法快速檢測單頭柑橘全爪螨F1538I突變，建立了一種方便有效的分子標記技術(shù)。在DNA提取中需要使用一些有機溶劑，這些試劑常具有揮發(fā)性，對人的身體健康具有一定危害，本發(fā)明方法可以有效的避免這一缺陷，且節(jié)省了時間和檢測成本；本發(fā)明方法操作簡便，所有反應(yīng)均在PCR儀內(nèi)完成，能夠檢測單頭樣品，一次同時檢測的樣品量大，可以快速有效的檢測柑橘全爪螨田間種群在F1538位點的基因型，可以快速有效地評估突變位點在某個種群中的頻率，為柑橘全爪螨對擬除蟲菊酯類藥劑的田間抗性檢測提供分子工具。
【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例中酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明實施例中所用試劑來源如下:
[0026]2XPhire 動物組織 PCR 緩沖液(Thermo Scientific 公司，美國)
[0027]Phire 熱啟動 II DNA 聚合酶(T