一株在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌。
【背景技術】 植物內(nèi)生菌的研宄始于19世紀末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L?種子中分離 出第一株內(nèi)生菌。但真正開始大量研宄植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀八十年代，主要是在 溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研宄。 植物內(nèi)生真菌的分布廣、種類多，前人研宄表明從絕大多數(shù)植物體內(nèi)都能分離得到內(nèi) 生真菌，由此可見內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個屬290多 種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨特功能可 以分為：固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病蟲害的生防菌和具有促進植物對 不良環(huán)境的修復能力的抗性菌。 目前，有關內(nèi)生真菌對千年桐生長的影響研宄還存在空白。

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的在于提供一株在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌。
[0002] 該真菌為青霉屬（/令沙.）SJ3,已于2015年1月30日在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保 藏號為 CGMCC No. 10468。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案： 該菌的分離、純化包括： A、 材料：將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到 自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存； B、消毒：75%酒精漂洗30s-無菌水沖洗3-4次一15%的次氯酸鈉漂洗(根7min，莖 5min，葉3min)-無菌水沖洗4-5次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在 平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表 面消毒不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法； C、 接種部位的選擇：葉片：葉尖部、葉中部和葉基部3個處理；枝莖：上中下分為3部 位，其中第3部位為枝莖交接處；根部：分為根尖和根基2個部分； D、 接種：將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)5- 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進行分離純 化；生長緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩(wěn)定后純化； 固體培養(yǎng)：使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、 葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0. 5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值 6. 4 ±0. 2,培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)； E、 將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進行純化，經(jīng)過2-3次點接純 化、轉接后得到單一菌種的上述的功能菌株； 上述的一種在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌應用菌液的制備方法，是 將上述的菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h，利用 血球計數(shù)板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9. 0X106cfu/ml即為成品備用；液 體培養(yǎng)基：為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、 磷酸氫二鉀1. 〇g/L、硫酸鎂0. 5g/L、其它為無菌水、pH值6. 4±0. 2。 上述的一種在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌應用菌液的應用方法，是 應用該菌株的菌液用于千年桐苗木根際土壤澆施或苗木直接接種。 上述的一種在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌應用菌液的應用方法，是 用5. 5X 106cfu/ml菌液，按每株100ml在林地饒于每株千年桐的根際。 本發(fā)明涉及的菌株是從千年桐植株中分離純化得到的，經(jīng)接種于千年桐土培苗，根據(jù) 各項指標綜合評判，進一步證實其在低磷環(huán)境下能促進千年桐生物量的增長，尋找到對促 進植株生物量增長的有益的功能內(nèi)生真菌可應用于生產(chǎn)。
[0003]通過菌液澆施的方法接種于千年桐幼苗，并在接種15天后進行低磷脅迫試驗，在 脅迫15d時、30d時、45d時、60d時進行取樣測定植株葉片酸性磷酸酶活性，并在脅迫至60d 時測定其生物量及根系酸性磷酸酶活性。根據(jù)測得的各項指標綜合評判，進一步證實其對 植株生長具有緩解低磷脅迫的作用，尋找到對促進植株生物量有益的功能內(nèi)生真菌可應用 于生產(chǎn)。通過對植株生物量、葉片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性的測定，得出接種 該菌株的處理的生物量、葉片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性均基本較大程度高于 對照，表明其在低磷環(huán)境下對促進植株生物量增長具有很大功用，從而進一步證實得到該 株內(nèi)生真菌能在低磷環(huán)境下促進千年桐植株生物量生長。
【附圖說明】
[0004] 圖1為不同低磷脅迫條件下不同處理對千年桐幼苗生物量的影響。
[0005] 圖2為不同低磷脅迫條件下不同處理對千年桐幼苗葉片酸性磷酸酶活性的影響。
[0006] 圖3為不同低磷脅迫條件下不同處理對千年桐幼苗根系酸性磷酸酶活性的影響。
【具體實施方式】
[0007] -、根際土壤澆施與苗木直接接種應用 試驗材料為千年桐幼苗為建陽市林業(yè)局提供的千年桐一年生苗。本試驗采用土培盆栽 試驗，選擇長勢一致的苗木于2015年5月定植于直徑15cm，高10cm的塑料盆中。每盆放入 相等質(zhì)量的3kg黃心土，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入10-15滴甲醛 (福爾馬林）消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內(nèi)甲醛滲透消毒完 全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發(fā)，以免影響幼苗的移植成活率。將苗木植入，經(jīng)過一個 月的恢復性生長，在千年桐幼苗根際施入菌株濃度為5. 5 X 106cfu/ml的菌液100ml，連續(xù)三 天澆施，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。
[0008] 菌液制備：將供試菌株接入50mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中 蛋白胨5. Og/L、酵母浸出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀1. Og/L、硫酸鎂0. 5g/L、 其它為無菌水、pH值6. 4±0. 2,在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72h的培養(yǎng)。用無菌生理鹽水按 十倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計數(shù)板計算菌液濃度配制成5. 5X 106cfu/mL。
[0009] 二、低磷脅迫試驗設計 盆栽試驗土壤的基質(zhì)為黃心土。經(jīng)測定該土壤中各養(yǎng)分物質(zhì)見表1。接種15天后進行 低磷脅迫試驗處理，這段時間主要是讓接種菌株侵入植株。
[0010] 表1基質(zhì)土壤養(yǎng)分情況 Table1Nutrientcontentofbasicsoil單位：mg/g\
【主權項】
1. 一株在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌，其特征在于：該真菌為青霉 屬腫5/7. )SJ3,已于2015年1月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心登記保藏，保藏號為CGMCCNo. 10468。
2. -種如權利要求1所述的一株在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌的 應用菌液，其特征在于：所述應用菌液的制備方法，將所述的青霉屬5/7. )SJ3 菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間48~72h，利用血球計數(shù) 板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成I. 0-9. 0X106cfu/ml，備用；液體培養(yǎng)基：為改良 馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、磷酸氫二鉀I.Og/ U硫酸鎂0. 5g/L、其它為無菌水、pH值6. 4±0. 2。
3. -種如權利要求2所述的應用菌液的用途，其特征在于：所述應用菌液用于千年桐 苗木根際土壤澆施或苗木直接接種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株在低磷環(huán)境下促進千年桐生物量增長的內(nèi)生真菌。所述內(nèi)生真菌為青霉屬（Penicillium sp.）SJ3，已于2015年1月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏號為CGMCC No. 10468。將千年桐內(nèi)生真菌SJ3接種于千年桐土培苗，通過對植株生物量、葉片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性的測定，得出接種該菌株的處理的生物量、葉片酸性磷酸酶活性及根系酸性磷酸酶活性均基本較大程度高于對照，表明其在低磷環(huán)境下對促進植株生物量增長具有很大功用，從而進一步證實得到該株內(nèi)生真菌能在低磷環(huán)境下促進千年桐植株生物量生長。CGMCC No.1046820150130
【IPC分類】C12R1-80, A01G7-06, C12N1-14, A01P21-00, A01N63-04
【公開號】CN104762219
【申請?zhí)枴緾N201510174479
【發(fā)明人】林晗, 陳建忠, 洪滔, 洪陳潔, 謝安強, 吳承禎
【申請人】福建農(nóng)林大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月14日