一種花生果腐病病原菌的快速培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種花生果腐病病原菌的快速培養(yǎng)方法，屬于花生病原菌培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，近年來花生果腐病，俗稱爛果病，在我國花生產(chǎn)區(qū)尤其是北方產(chǎn)區(qū)呈連年加重之勢。果腐病是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的花生土傳病害之一，危害嚴(yán)重，難于治理，一般發(fā)病田產(chǎn)量損失達(dá)15%左右，重病田可致絕收。因此，果腐病病原菌的篩選、培養(yǎng)與致病性研宄變得至關(guān)重要，它是花生果腐病抗病種質(zhì)培育與抗病機(jī)制研宄的重要基礎(chǔ)，更是徹底實(shí)現(xiàn)花生果腐病防控的關(guān)鍵所在。
[0003]由于花生果生長于土壤中的特殊性，使得花生果表面的附著菌與內(nèi)生菌多樣性很高，加大了病原菌的篩選難度。而大多數(shù)真菌本身存在生長周期較長、傳代慢的特點(diǎn)，因此要想快速獲得致病性穩(wěn)定的純培養(yǎng)物，必須采用合適的選擇性培養(yǎng)方法并縮短其傳代周期。另外，抗病花生種質(zhì)的篩選、鑒定試驗(yàn)尤其是田間試驗(yàn)必須同期內(nèi)接入大量的病原菌，這對病原菌的快速、大量繁殖技術(shù)又提出新要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種花生果腐病病原菌的快速培養(yǎng)方法，以達(dá)到短期內(nèi)獲得純培養(yǎng)、致病性穩(wěn)定的花生果腐病病原菌的目的，并實(shí)現(xiàn)快速、大量繁殖，以滿足花生抗病種質(zhì)篩選短期內(nèi)的大量需求，對花生果腐病抗病品種的選育及抗病機(jī)制的研宄具有重要意義。
[0005]該方法包括如下步驟:采用打孔法將分離、純化的高致病性花生果腐病病原菌Calonectria sp.轉(zhuǎn)接到改良察氏液體培養(yǎng)基上富集培養(yǎng)，之后將富集液涂布到改良察氏培養(yǎng)基平板上暗培養(yǎng)。如此對所得純培養(yǎng)進(jìn)行快速傳代，選取經(jīng)50次傳代后致病性穩(wěn)定的菌株進(jìn)行保藏。對凍存菌，則采用先活化、后富集、之后擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，實(shí)現(xiàn)快速、大量培養(yǎng)的目的，
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了上述花生果腐病病原菌的快速培養(yǎng)方法的優(yōu)選技術(shù)方案:
作為優(yōu)選，所述的花生果腐病病原菌是從花生果腐病病果中分離純化獲得，回接實(shí)驗(yàn)證明其具有高致病性，其ITS序列經(jīng)比對與Calonectria相似度為99%。該菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2014.10.20，保藏號為CGMCC N0.9807ο
[0006]作為優(yōu)選，所述的花生果腐病病原菌的ITS序列為:TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCATGTGAACATACCTGTTTCGTTCCCTCGGCGGTGTCCGGCAACGGCCCGCCAGAGGACCCAACAAACTCTTTTGAATTTTTCAGTATCTTCTGAGTGAAAAAAACAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCTTCGGGAGCTTGGTGTTGGGGATCGGCAGGGCGTCCTCCGGGTCGCGCCGTCCCCCAAATCTAGTGGCG
GTCTCGCTGTAGCTTCCTCTGCGTAGTAATACACCTCGCTCTGGAGTCTCGGTGCGGCCACGCCGTTAAACCCCCAA
CTATTTTCTGGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGo
[0007]作為優(yōu)選，所述的富集培養(yǎng)是用打孔法將5mm直徑的純培養(yǎng)菌斑轉(zhuǎn)接到盛有20ml改良察氏液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于搖床中以28°C、200rpm震蕩12h。然后取Iml富集液涂布到改良察氏培養(yǎng)基平板上，至少做5個重復(fù)，暗培養(yǎng)2天，選取光滑、濕潤、粘稠的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0008]作為優(yōu)選，所述的改良察氏培養(yǎng)基配方為硝酸鈉2g，磷酸氫二鉀0.7g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.0lg,吐溫0.5g，鹿糖30g，瓊脂20g，蒸飽水1000mL，PH*6.8。
[0009]作為優(yōu)選，所述的活化是指用接種針挑取甘油凍存菌到盛有5ml改良察氏液體培養(yǎng)基的1ml離心管中，于搖床中以28°C、200rpm震蕩6_8h。
[0010]作為優(yōu)選，所述的富集是指將權(quán)利要求6中所述的5ml培養(yǎng)液移入盛有50ml改良察氏液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，28°C、200rpm震蕩16h。
[0011]作為優(yōu)選，所述擴(kuò)大培養(yǎng)是指取1.5ml權(quán)利要求7中所述的富集培養(yǎng)液，涂布于12cm直徑的改良察氏培養(yǎng)基平板上，存留于超凈工作臺晾干后，按上述方法重復(fù)涂布兩次，待晾干后置于培養(yǎng)箱28°C暗培養(yǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明包括但不限于以下實(shí)施方式。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)對本發(fā)明所進(jìn)行的不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的改變，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]實(shí)施例:
在青島萊西花生生產(chǎn)試驗(yàn)基地于收獲期選取兩個果腐病發(fā)病比較嚴(yán)重的材料花育38號和花育43號，分別選取5株?duì)€果率在50%以上的植株。將5株植株的病果混合后裝入封口袋中，用放有冰袋的泡沫盒低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0014]兩個花生材料分別隨機(jī)選取10個病果作為實(shí)驗(yàn)材料，并分別做兩組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)步驟均為無菌操作。病果用無菌水漂洗3-4次，去掉泥土與表面附著物，之后在超凈工作臺用無菌濾紙吸干水分并用滅過菌的剪刀剪碎。將剪碎后的病果至于盛有50ml改良馬丁液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于搖床中以28°C、200rpm震蕩5h后，3000g離心5min，上清液按10_\10_2、10_3、10_4、10_5進(jìn)行梯度稀釋后在平板上劃線、分離。挑取形態(tài)不同的單菌落繼續(xù)劃線、純化培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法和分子生物學(xué)鑒定方法(ITS序列測序)相結(jié)合，對純培養(yǎng)的微生物進(jìn)行鑒定分類。獲得7株可能與花生果腐病相關(guān)的菌株，且在兩個花生材料中均存在。對這7株菌分別進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其中的Calonectria印.為高致病性菌株，對選取的四個感病花生品種可達(dá)到100%致病，田間接種實(shí)驗(yàn)爛果率達(dá)到30%以上。
[0015]由于該菌在改良馬丁培養(yǎng)基上生長緩慢，所以我們對其傳代培養(yǎng)條件進(jìn)行了改良。用打孔法將5mm直徑的純培養(yǎng)菌斑轉(zhuǎn)接到盛有20ml改良察