一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 石油烴類(lèi)污染已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)的重要的環(huán)境污染問(wèn)題之一。石油是由數(shù)百 種化合物組成的復(fù)合體，烷烴作為石油最重要的成分之一，占石油總質(zhì)量的20-50%以上。 在自然環(huán)境中，短鏈烷烴易揮發(fā)，中鏈烷烴可以被微生物降解，而不易揮發(fā)、低溶解性的長(zhǎng) 鏈烷烴和環(huán)烷烴則屬于很難被生物降解的污染物，對(duì)環(huán)境的危害較持久，因此環(huán)境中烷烴 的去除一直以來(lái)都是研宄的熱點(diǎn)。
[0003] 去除烷烴的方法主要包括物理、化學(xué)和生物等方法。其中，生物方法具有不造成二 次污染、費(fèi)用低、原位降解污染物等特點(diǎn)，是一種極有前途的技術(shù)。目前已經(jīng)報(bào)道的烷烴降 解微生物主要有假單胞菌、不動(dòng)桿菌、諾卡氏菌、紅球菌等，但高效廣譜降解菌株少，其中大 多數(shù)菌株降解譜為C 1(|-C2(l烷，而少數(shù)降解譜較寬的菌株如諾卡氏菌降解原油中長(zhǎng)鏈烷烴的 效率則較低。而且用于環(huán)境修復(fù)的外源微生物引進(jìn)土壤環(huán)境后，容易受到土著微生物的競(jìng) 爭(zhēng)、排斥，影響其存活、繁殖。因此需要建立一種高效廣譜降解烷烴強(qiáng)化生物修復(fù)方法。
[0004]國(guó)內(nèi)外研宄表明，微生物分泌的酶是降解有機(jī)污染物的決定因素。微生物降解酶 主要有兩種，分別為胞內(nèi)酶和胞外酶。許多研宄發(fā)現(xiàn)，降解有機(jī)物的酶主要位于胞內(nèi)。因此， 破碎微生物細(xì)胞而釋放出酶液，對(duì)于利用有機(jī)污染物降解至關(guān)重要。與投放活體微生物相 比，投放降解酶具有以下優(yōu)勢(shì)：（1)不需要對(duì)環(huán)境的適應(yīng)期；(2)對(duì)環(huán)境適應(yīng)的范圍比微生 物本身要廣，如pH、溫度、濕度等；（3)無(wú)論環(huán)境污染物的濃度大小，酶對(duì)底物均具有專(zhuān)一、 高效性；(4)容易進(jìn)入土壤空隙與底物結(jié)合，而且酶活容易控制；（5)受代謝產(chǎn)物的抑制作 用較小。因此酶和酶技術(shù)在環(huán)境有機(jī)污染治理方面具有廣泛的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種烷烴降解酶制劑及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種烷烴降解酶制劑，烷烴降解酶制 劑為經(jīng)破碎處理后的地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物；
[0007] 所述地衣芽抱桿菌PS5 (Bacillus licheniformis PS5)已于2011年7月19日保 藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M2011261。
[0008] 將地衣芽孢桿菌接種到含有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌體后 超聲破碎即得烷烴降解酶制劑。
[0009] 將體積百分比5-10%的地衣芽孢桿菌接種于含有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于 25-30°C，150-200rpm/min振蕩培養(yǎng)48-60h ;而后按體積百分比5-8%的接種量將培養(yǎng)液 接種到含有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于25-28°C發(fā)酵到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；于6000-8000rpm/ min下離心5-10min收集菌體；
[0010] 將收集的菌體用5-10倍體積的pH 6.0的PBS緩沖液重懸菌體，然后進(jìn)行超 聲波破碎，超聲功率為200-500W，超聲破碎時(shí)間為25-35min ;然后在2-8 °C條件下，經(jīng) 6000-8000rpm/min離心5-10min，取上清液，即為燒徑降解酶制劑。
[0011] 所述含有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基組成為：正十六烷〇. 5-2. Og/L，環(huán)十二烷 0. 2-0. 5g/L,0. 5g/L NaCl,0. 2g/L MgS04,0. 5g/L(NH4)2S04,1. 5g/L K2HP04,0. 5g/L KH2P04, 0? 05g/L CaCl2,0? 02g/L FeS04,0? 002g/L 酵母粉，PH 值 7. 0。
[0012] 所述 PBS 緩沖液由 16ml 0. 2mol/L NaH2P(VK溶液和 84ml 0. 2mol/L 恥2冊(cè)04水溶 液混合制成。
[0013] 所述酶制劑作為污染環(huán)境中的烷烴降解酶制劑，用于治理污染環(huán)境。
[0014] 所述酶制劑用于降解污染水體或土壤中的烷烴。
[0015] 所述酶制劑中加入2_4mmol/L的Fe2+或2_4mmol/L摩爾比為1:1的Fe 2+/Fe3+，施 用于污染水體或土壤中進(jìn)行降解烷烴，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)的目的。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0017] 1.本發(fā)明的酶制劑含有參與烷烴降解的多種酶，施用于受污染的水體或土壤后可 直接對(duì)烷烴進(jìn)行降解，具有效率高、成本低的特點(diǎn)，較微生物降解速度提高40-60倍。
[0018] 2.本發(fā)明制劑較降解微生物受環(huán)境影響小，不需要對(duì)環(huán)境的適應(yīng)期，可保持較高 的生物活性，可以將烷烴徹底的降解為〇) 2和H 20。
[0019] 3.輔助金屬離子的添加進(jìn)一步提高酶劑作用效率。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同金屬離子鹽溶液對(duì)水相中酶制劑對(duì)烷烴降解作 用的影響效果圖；
[0021] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同金屬離子鹽溶液對(duì)土壤中酶制劑對(duì)烷烴降解作 用的影響效果圖；
[0022] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的烷烴降解酶劑與電動(dòng)修復(fù)組合修復(fù)烷烴污染土壤效 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 實(shí)施例1、烷烴降解酶制劑的制備及其對(duì)水體中烷烴的降解
[0024] 1)烷烴降解酶制劑的制備
[0025] 選取烷烴高效降解菌株地衣芽孢桿菌進(jìn)行種子液培養(yǎng)，將單克隆菌種接種到含 有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于28°C，180rpm/min振蕩培養(yǎng)60h;而后按體積百分比5% 的接種量將上述培養(yǎng)的菌種重新接種到含有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基內(nèi)振蕩培養(yǎng)，于28°C 發(fā)酵到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0D 6CICI= 0. 6);將發(fā)酵液于6000rpm/min下離心10min，收集菌體。
[0026] 收集的菌體用10倍體積的pH 6. 0的PBS緩沖液重懸菌體，然后進(jìn)行超聲波破碎， 處理?xiàng)l件為300W功率下超聲3s，停止3s，超聲破碎時(shí)間為30min ;然后在4°C條件下，經(jīng) 8000rpm/min離心10min，取上清液，即為燒徑降解酶制劑。
[0027] 地衣芽孢桿菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M 2011261，保藏日期為2011年7月19日，保藏單位地址為中 國(guó).武漢.武漢大學(xué)。
[0028] 含有烷烴的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基成分為：正十六烷0. 5g/L，環(huán)十二烷0. 3g/L，0. 5g/ L NaCl，0.2g/L MgS04,0.5g/L(NH4)2S04，1.5g/L K2HP04,0.5g/L KH2P04,0.05g/L CaCl2， 0? 02g/L FeS04,0? 002g/L 酵母粉，PH 值 7. 0。
[0029] 所述PBS緩沖液由16ml0.2M NaH2P(VK溶液和84ml0.2M Na2HP04水溶液混合制 成。
[0030] 采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)定酶制劑蛋白質(zhì)濃度，采用牛血清蛋白（BSA) 配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，依據(jù)外標(biāo)法對(duì)粗酶蛋白濃度進(jìn)行定量分析，經(jīng)測(cè)定，粗酶蛋白濃度 為 L 5mg/L〇
[0031] 2)烷烴降解酶制劑對(duì)水體中烷烴的降解
[0032] 烷烴污染水體中酶制劑降解活性測(cè)定反應(yīng)體系為：3mg酶制劑、20ml0. 2M pH 7. 5 的PBS緩沖液、500mg/L混合烷烴（250mg/L正十六烷和250mg/L環(huán)十二烷）、濃度均為 2mmol/L 的 Fe2+(FeS04)和 Fe3+(FeCl3);以及濃度之和為 2mmol/L 的 Fe2+/Fe3+(FeS04/FeCl3) (1:1)混合物。以只加酶制劑和只加PBS緩沖液的反應(yīng)體系作為對(duì)照，32°C反應(yīng)4h，試驗(yàn)重 復(fù)二次。
[0033] 水相中混合烷烴的殘留采用有機(jī)相與水相間的液-液萃取方法，選用二氯甲烷作 為萃取劑進(jìn)行烷烴浸提，采用氣相色譜（安捷倫7890)進(jìn)行定量測(cè)定。
[0034] 測(cè)定結(jié)果（圖1所示）表明：與只加PBS緩沖液處理PBS-CK相比，加酶制劑和鐵 離子處理（En、En_Fe 2+、En_Fe3+和En-Fe 2+/Fe3+)對(duì)正十六燒和環(huán)十二燒均有較好的降解效