一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的蔗糖異構酶突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性和催化效率提高的蔗糖異構酶突變體，屬于基因工程和 酶工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 蔗糖異構酶（EC 5. 4. 99. 11)，又稱異麥芽酮糖合酶，蔗糖變位酶，是一種工業(yè)應用 價值極高的異構酶，屬于a -淀粉酶13家族，可以高效催化異構蔗糖生成異麥芽酮糖和海 藻酮糖，異麥芽酮糖后續(xù)加氫可以生成異麥芽酮糖醇，異麥芽酮糖與異麥芽酮糖醇在醫(yī)藥 上具有極高的價值，兩者口感與蔗糖相似，特別是兩者不容易引起人體血糖的升高，非常適 合糖尿病患者的服用。利用蔗糖異構酶酶法轉化蔗糖，與化學法合成異麥芽酮糖相比，具有 轉化率高，反應時間短，生產成本低。因此，在工業(yè)生產中可以達到增加產量、提高設備利用 率、降低生產成本的目的。來源于Serratia plymuthica AS9鹿糖異構酶由600個氨基酸 組成，包含了三個結構域。在酶轉化底物生產產物時，溫度越高，可以抑制轉化過程中微生 物的生長，防止酶在轉化過程中被這些微生物降解。目前報道的大部分微生物來源的蔗糖 異構酶熱穩(wěn)定性均很差，本發(fā)明中野生蔗糖異構酶在50°C下半衰期僅為8min左右，45°C下 半衰期為40min。熱穩(wěn)定性差不利于鹿糖異構酶在工業(yè)上進行連續(xù)的酶轉化以及酶的儲藏 運輸，因此，通過蛋白質分子改造提高蔗糖異構酶的穩(wěn)定性顯得尤為重要。
[0003] 在蛋白質分子改造中，目前常用的方法有理性設計、非理性設計和半理性設計。三 種方法的主要區(qū)別在于是否充分了解酶蛋白分子結構以及是否需要使用生物信息學軟件 進行計算和預測。其中理性設計具有實驗成本低、簡單方便和時間短等優(yōu)點。B因子（原子 取代因素）指的是由熱運動和位置混亂引起的原子在其平衡位置周圍電子密度的模糊度。 B因子越大，代表結構中一個氨基酸的活動范圍越大，反之亦然。因此，氨基酸的B因子和 其柔性具有一定的關系，B因子高的氨基酸更容易發(fā)生形狀的改變和位置的移動，具有更好 的柔性。反之，B因子低的氨基酸具有更好的剛性，不易發(fā)生變形和位移。在受熱條件下， B因子高的氨基酸更容易受到影響而發(fā)生結構破壞，而導致酶活受到影響；而剛性好的B因 子低的氨基酸則能更好地保持其構象的穩(wěn)定，而維持酶活力。因此將蔗糖異構酶中B因子 最高的氨基酸進行突變，降低其B因子，有可能提高酶的熱穩(wěn)定性。Rosetta Design軟件可 以對突變位點進行穩(wěn)定性突變的預測，通過計算，將柔性較高的氨基酸（B因子值較大）替 換成剛性增強的氨基酸。Rosetta Design通過計算得到的氨基酸，它們的疏水原子被隱藏， 它們的極性原子具有形成氫鍵的潛能，同時Rosetta Design預測得到的蛋白質骨架具有 更低的能量。
[0004] 發(fā)明人前期對來源于普城沙雷氏桿菌（S.plymuthica)的蔗糖異構酶進行了異源 表達和定點突變改造，獲得了兩個熱穩(wěn)定性和分泌性能得到提高的蔗糖異構酶突變體（一 種熱穩(wěn)定性和分泌效率提高的蔗糖異構酶突變體及其制備方法.2014102014687)。得到的 突變體K576D和K576P熱穩(wěn)定性和分泌效率都得到了一定的提高（K576D和K576P在45°C 下半衰期分別是野生酶的1. 8和1. 4倍；搖瓶發(fā)酵時兩個突變體的胞外分泌效率分別是天 然酶的4. 6和4. 7倍），但是催化效率出現了不同程度的降低。為了進一步提高酶的應用性 能，本發(fā)明將B因子分析和Rosetta Design軟件計算相結合，選擇新的突變位點進行分子 改造，以進一步提尚鹿糖異構酶的熱穩(wěn)定性和催化效率。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明要解決的一個技術問題是提供一種蔗糖異構酶突變體，突變體與親本蔗糖 異構酶相比有更好的熱穩(wěn)定性和催化效率。所述親本基因與普城沙雷氏桿菌（Serratia plymuthica AS9)蔗糖異構酶基因（NCBI編號：NC_015567) -致，所述作為突變用的 質粒模板為攜帶天然蔗糖異構酶編碼基因的載體palI/pET24a(+)(中國專利，【申請?zhí)枴?2014102014687)。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種蔗糖異構酶突變體，所述突變體在氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1的基礎上，將第175位置的谷氨酸突變成天冬酰胺，命名為E175N。
[0007] 編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實施方式中是SEQIDN0. 2 所示的序列。
[0008] 所述突變體，在本發(fā)明的一種實施方式中，還包括同時將第576位的賴氨酸突變 為谷氨酸，所得突變體命名為E175N/K576D。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是一種制備所述突變體的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)對鹿糖異構酶晶體結構進行分析，確定B因子較高的氨基酸，并結合Rosetta Design軟件分析確定突變成何種氨基酸可以降低B因子；
[0011] 2)設計定點突變所用引物，以攜帶蔗糖異構酶編碼基因的載體為模板進行突變并 構建兩種突變體的質粒載體；
[0012] 3)將突變質粒轉化進宿主細胞；
[0013] 4)挑選陽性克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)，純化獲得蔗糖異構酶突變體。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有所述突變體的氨基酸序列的重組質粒載體。
[0015] 所述質粒載體，在本發(fā)明的一種實施方式中，是pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、 或PAN系列、或pUB中的任意一種。
[0016] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種表達所述突變體的細胞。
[0017] 所述細胞，在本發(fā)明的一種實施方式中，是細菌、酵母或者真菌。
[0018] 本發(fā)明還要求保護所述突變體在生產異麥芽酮糖或海藻酮糖或異麥芽酮糖醇方 面的應用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明構建了兩個熱穩(wěn)定性和催化效率均得到了提高的蔗糖異構酶突變體E175N 和 E175N/K576D。
[0021] (1)熱穩(wěn)定性：在pH6.0,45°C的水浴中，突變體E175N和E175N/K576D的半衰 期為90. 2min和300min左右，相比天然蔗糖異構酶半衰期的39. 2min，分別提高了 130%、 665 % 〇
[0022] (2)催化效率：酶動力學分析顯示，E175N和E175N/K57D的Km值分別比天然酶下 降了 6. 6%和11%;催化效率Keat/Km分別提高了 38%和19%。催化蔗糖生產異麥芽酮糖 時，突變體的異麥芽酮糖最大轉化率分別比天然酶提高了 1.8%和1.6%。
[0023]因此，蔗糖異構酶突變體比親本更適合蔗糖異構酶的運輸保藏和在催化蔗糖生成 異麥芽酮糖過程中的應用。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :天然蔗糖異構酶三維模擬結構；
[0025] 圖2:天然酶與突變體在45°C、pH 6. 0保溫20min后的殘留酶活比較；
[0026] 圖3:天然蔗糖異構酶及三種突變體純酶SDS-PAGE凝膠電泳；其中，M代表蛋白分 子量標準，泳道1為天然蔗糖異構酶，泳道2為突變體E175N;泳道3為突變體K576D;泳道 4 為突變體 E175N/K576D;
[0027] 圖4:天然蔗糖異構酶及其突變體的酶學性質比較，其中（a)為最適溫度，（b)為 45 °C下的熱穩(wěn)定性；
[0028] 圖5 :天然蔗糖異構酶及其突變體30°C下制備異麥芽酮糖的轉化率。
【具體實施方式】
[0029]實施例1:蔗糖異構酶定點突變體的制備[0030] (1)蔗糖異構酶定點突變體的構建
[0031] 來源于S. plymuthica的蔗糖異構酶2種定點突變體E175N和E175N/K576D:
[0032] 本發(fā)明中，以相似度最高的Protaminobacter rubrum CBS 574. 77鹿糖異構酶 (SmuA)晶體結構（PDB ID: 3GBD)為模板，通過EMBI-EBL在線服務器構建了 S. plymuthica AS9蔗糖異構酶（Pall AS9)的三維模擬結構（圖1)。通過氨基酸一級序列比對發(fā)現，SmuA 和Pall AS9兩者之間只有一個氨基酸不同，相似度達到99. 86%，因此可以認為Pall AS9 有著SmuA近乎相同的三維結構和B因子參數?；谏鲜龇治觯x擇Pall AS9中6個具有 較高的B因子的氨基酸殘基（表1)，之后利用Rosetta Design軟件將它們替換成剛性增強 的理想目標氨基酸。根據軟件分析預測的結果，利用PCR介導的定點突變方法分別構建除 之前已成功構建的K576D的剩下5種突變體N577K、S575D、K174D、E175N和G176D。
[0033] 5種定點突變體的制備方法，根據S. plymuthica鹿糖異構酶的序列（氨基酸序列 如SEQ ID NO. 1所示，核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示），分別設計并合成引入定點突變的 引物，對蔗糖異構酶N577、S575、K174、E175和G176位置進行定點突變，測定DNA編碼序列， 分別測序確認蔗糖異構酶突變體的編碼基因是否正確；將突變體基因連接到適當的表達載 體中并導入大腸桿菌中進行表達，得到5種蔗糖異構酶定點突變體。
[0034] 定點突變體編碼基因的PCR擴增：利