一個簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因及其表達載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12 及其表達載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 小麥是我國乃至世界最重要的糧食作物之一，其生長發(fā)育卻受多種非生物和生物 脅迫。由小麥白粉菌炬lumeriagraminisf.sptritici)引起的小麥白粉病是小麥主要的 病害之一。它屬于?；纳?，可W在整個生育期侵染小麥的葉部、莖桿、穗部等。其中主要 危害小麥葉片，嚴重時影響小麥正常的光合作用，從而影響其正常的生長，降低產(chǎn)量。一般 情況下，小麥白粉病能夠引起小麥減產(chǎn)5-19%，嚴重情況下能夠使小麥減產(chǎn)30%W上（李 振岐等，1997)。從九十年代W后，全國每年小麥白粉病的發(fā)病面積在600萬公頃W上，嚴重 危害小麥生產(chǎn)安全，因此小麥白粉病的防治越來越受到人們的關(guān)注。選育抗白粉病小麥品 種是最有效的方法，而挖掘新的抗白粉病基因及解析抗病信號途徑的分子機制將為抗性基 因的選育奠定基礎(chǔ)。
[0003] W往對小麥白粉病抗性的研究主要集中在抗白粉病基因的發(fā)掘和克隆方面，雖然 已經(jīng)發(fā)掘到很多抗白粉病基因，但是由于小麥基因組的復(fù)雜性使得抗白粉病基因的克隆異 常艱難，限制了對抗性機制的系統(tǒng)研究。在小麥的一個野生近緣種簇毛麥的6V染色體上具 有廣譜抗白粉病的主效基因化21，而研究化21基因發(fā)揮抗病作用過程中所設(shè)及的信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑基因和重要的防衛(wèi)反應(yīng)基因，對于了解廣譜抗性的分子機理，運用基因工程手段提 高小麥對白粉病的抗性具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶 基因HV-MPK12。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供該基因的表達載體。
[0006] 本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達載體的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[000引絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12,來自簇毛麥，其核巧酸序列為SEQIDNO. 1。
[0009] 該簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)HV-MPK12,其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2。
[0010] 含有所述的簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12的表達載體。
[0011] 含有所述的簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12的表達載體優(yōu)選W地I 220-6為出發(fā)載體，將所述的HV-MPK12基因插入地I220-6的BamHI和化nI酶切位點間 所得。
[0012] 所述的簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12在培育抗白粉病小麥品種中的 應(yīng)用。
[0013] 所述的簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12的表達載體在培育白粉病小麥 品種中的應(yīng)用。
[0014] 有益效果；
[0015] 本發(fā)明從簇毛麥中克隆得到了一個絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12及其所編 碼的蛋白質(zhì)HV-MPK12。HV-MPK12可用于基因工程育種，將其插入表達載體地I220-6,得 到該基因的過量表達載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可W提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗 性。
【附圖說明】
[0016] 圖1 HV-MPK12在簇毛麥葉片經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后的實時定量qPCR分析
[0017] 0h、2h、化、1化、2化、4她、7化分別表示白粉病菌誘導(dǎo)了Oh、化、6h、12h、2化、4她、 7化的簇毛麥葉片cDNA樣品。
[001引圖2 HV-MPK12過量表達載體構(gòu)建
[0019] 圖3 HV-MPK12基因轉(zhuǎn)化揚麥158的T。代陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子鑒定結(jié)果
[0020] M:化2000, "Y158"泳道為受體揚158對照，泳道為水對照，"+ "泳道為質(zhì)粒對 照，其余編號泳道為不同的T。代轉(zhuǎn)基因植株。箭頭所示為擴增出的目標基因片段。
[0021] 圖4轉(zhuǎn)基因HV-MPK12 T。代植株苗期白粉病鑒定
【具體實施方式】
[0022] 實施例1簇毛麥絲裂原活化蛋白激酶基因HV-MPK12的克隆
[002引本實驗室前期利用簇毛麥受白粉菌誘導(dǎo)后的cDNA樣品與大麥表達譜巧片Barley 1 GeneChip(http://www. affymetrix. com/products/arrays/specific/barley.affx)進 行雜交，通過比較接種白粉菌前后抗病簇毛麥的表達譜，篩選出上調(diào)表達的基因，包括病 程相關(guān)蛋白、防衛(wèi)反應(yīng)基因、轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導(dǎo)因子和抗病基因類似物等。根據(jù)巧片雜 交結(jié)果，選擇上調(diào)表達、根據(jù)抗病相關(guān)巧離子通道基因設(shè)計的探針Contig4711，經(jīng)NCBI注 釋為一個MAPK類基因，根據(jù)大麥的cDNA庫（公知公用）序列用Primer3化ttD://www. genome, wi. mit. edu/cgi-bin/primer/primer3www. cgi)設(shè)計全長弓I物，弓I物對序歹ll為 P1(ATGGGGGGAGGGAACGGCAT(SEQ ID NO. 3))和P2(CTAGGCATGCATCTTGGAGA(SEQ ID NO. 4)) 對簇毛麥受白粉菌誘導(dǎo)2化cDNA進行PCR擴增，經(jīng)過篩選得到陽性單克隆進行測序，獲得 HV-MPK12基因的cDNA全長。
[0024] 測序結(jié)果表明，該基因完整的開放閱讀框為152化P，序列如SEQIDNO. 1所示， 編碼506個氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。通過對該氨基酸序列進行保守結(jié) 構(gòu)分析，HV-MPK12基因推導(dǎo)的蛋白序列屬于植物的類PKc超家族，該蛋白序列在15-306 位置包含一個MAPKinase催化結(jié)構(gòu)域；S_TKc，在催化結(jié)構(gòu)與前具有一個ATP結(jié)合位點 和底物結(jié)合位點。經(jīng)BLAST分析，HV-MPK12基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列與面包小麥中的MAP Kinase拍enBankaccessionABC54587. 1)具有99%-致性；與大麥的MAPKinase(GenBank accessionCAD42638. 1)具有 98% -致性；與水稻的MAPKinase12(GenBankaccession AAF23902. 1)有88% -致性；與玉米的MAPKinase(GenBankaccessionAFW75830. 1)具有 87% 的一致性；與擬南芥的MAPKinase(GenBankaccessionBAB02016. 1)具有 76% -致 性。故將該基因命名為HV-MPK12。
[0025] 實施例2白粉菌誘導(dǎo)后HV-MPK12的表達特征分析
[0026] 把簇毛麥的非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)不同時間的樣品的cDNA為模板、W引物對P3(CTAGCTAG CTGGGGCTAATGTATTTCATC(SEQIDNO. 5))和P4 (CTAGCTAGCAAAAGGAGCCACATAATTCA(SEQID N0.6))進行實時巧光定量qPCR分析，W