一種體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域，特別是一種采用純化的草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carpreovirus, GCRV)核心與采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外衣殼蛋白VP5和VP7進(jìn)行體外重組形成完整病毒顆粒的方法。所用病毒株為草魚(yú)呼腸孤病毒湖南邵陽(yáng)株GCRV873，已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏編號(hào)是CCTCC NO:V200414。
【背景技術(shù)】
[0002]草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類之一，在幼苗時(shí)易感染草魚(yú)呼腸孤病毒，該病毒可引暴流行性草魚(yú)出血病，并造成大批草魚(yú)魚(yú)苗死亡，給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于病毒侵染機(jī)制的研宄有利于找到抗病毒藥物作用的靶點(diǎn)，為抗病毒藥物的研制及病毒性疾病的預(yù)防提供有效途徑。GCRV是由雙層衣殼組成的無(wú)囊膜病毒，內(nèi)衣殼包括VP1-VP4和VP6五種蛋白，而外衣殼由VP5和VP7異源三聚體復(fù)合物組成。不同于囊膜病毒采用膜融合進(jìn)入細(xì)胞的途徑，GCRV的早期感染可能與外衣殼蛋白VP5和VP7介導(dǎo)的膜滲透有關(guān)，但對(duì)其進(jìn)入細(xì)胞的分子機(jī)制知之甚少。
[0003]目前，結(jié)構(gòu)生物學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示外衣殼蛋白VP5和VP7在GCRV侵染過(guò)程中有著重要功能，鑒于GCRV基因組是由11條分段的雙鏈RNA組成，與其他雙鏈分段RNA病毒一樣，目前尚無(wú)法利用反向遺傳學(xué)即通過(guò)基因水平的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白功能的研宄，限制了對(duì)外衣殼蛋白在GCRV侵染過(guò)程中介導(dǎo)的膜滲透機(jī)制的研宄，故有必要提供一種能有效地從分子水平揭示外衣殼蛋白VP5和VP7所介導(dǎo)的GCRV侵染機(jī)制的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本研宄提供一種體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒制備方法，以便為從分子水平揭示GCRV侵染的分子機(jī)制及抗病毒藥物的研發(fā)以及為草魚(yú)出血病防治開(kāi)辟新的有效途徑。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明提供的體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒制備方法，是一種草魚(yú)呼腸孤病毒GCRV核心與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外衣殼蛋白VP5和VP7的體外組裝的方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)增殖 GCRV873:
[0008]采用草魚(yú)腎細(xì)胞系即CIK細(xì)胞增殖GCRV873，GCRV873是草魚(yú)呼腸孤病毒湖南邵陽(yáng)株;
[0009](2)含有核酸的病毒核心的獲取及離心純化:
[0010]采用胰蛋白酶處理純化的病毒，以降解外衣殼蛋白VP5和VP7，獲得含有核酸的病毒核心，并采用氯化銫(CsCl)密度梯度進(jìn)行離心純化；
[0011 ] (3)外衣殼蛋白VP5和VP7的表達(dá):
[0012]采用重組桿狀病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染昆蟲(chóng)細(xì)胞系即Sf9細(xì)胞，以進(jìn)行外衣殼蛋白VP5和VP7的大量表達(dá)；
[0013](4)體外組裝:
[0014]將純化的GCRV核心與在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的外衣殼蛋白VP5和VP7按照合適的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行混合孵育，實(shí)現(xiàn)GCRV的體外組裝；
[0015](5)離心純化:
[0016]采用CsCl密度梯度對(duì)體外組裝后的病毒顆粒進(jìn)行離心純化，得到純化的體外組裝病毒粒子(R-GCRV)，其為具有感染性的體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒顆粒。
[0017]所述的體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒顆粒，其所用核心顆粒濃度或顆粒數(shù)應(yīng)達(dá)到1.2mg/mL 或 112個(gè) /mL。
[0018]采用Sf9細(xì)胞大量表達(dá)外衣殼蛋白VP5和VP7后，其細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)到17個(gè)/mL。
[0019]體外組裝過(guò)程是:采用10mmol/L PBS (磷酸鹽緩沖液)將純化的病毒核心分別稀釋成濃度為0.8-1.2mg/mL或顆粒數(shù)約為18-1O12個(gè)/mL，將vAcGCRV_VP5/VP7感染的Sf9細(xì)胞分別稀釋成細(xì)胞數(shù)為15-1O7個(gè)/mL，其稀釋的細(xì)胞經(jīng)凍融后，將二者按照不同的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行混合，28°C孵育3h，完成體外組裝。
[0020]離心純化時(shí)，采用30-50% CsCl密度梯度離心進(jìn)行體外組裝病毒的純化，大約在40% CsCl密度梯度中獲得大量體外組裝的重組病毒完整顆粒。
[0021]本發(fā)明可以采用空斑分析法對(duì)R-GCRV的感染性進(jìn)行測(cè)定。
[0022]本發(fā)明采用20mM NH4Cl進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)，對(duì)R-GCRV與N-GCRV的感染性進(jìn)行分析，以驗(yàn)證二者的感染途徑。
[0023]本發(fā)明將純化的病毒核心與在Sf9細(xì)胞中表達(dá)外衣殼蛋白VP5和VP7至少按照101°:1O6個(gè)/mL比例混合孵育。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下主要優(yōu)點(diǎn):
[0025]其一.此方法簡(jiǎn)單、操作方便，有效克服了分段基因組病毒難于實(shí)施反向遺傳學(xué)操作技術(shù)的局限性；
[0026]其二.此方法包裝效率高，將外衣殼蛋白VP5和VP7與純化的GCRV核心按照最適化學(xué)計(jì)量比混合孵育，可獲取大量具有較高感染性的R-GCRV ；
[0027]其三.實(shí)驗(yàn)證實(shí)R-GCRV與N-GCRV具有相同的感染機(jī)制，該體外組裝病毒方法將成為研宄GCRV侵染機(jī)制的一個(gè)有效工具。
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1是空斑實(shí)驗(yàn)測(cè)定體外重組病毒的感染性示意圖。
[0029]圖中:A行1、2列為R-GCRV感染CIK細(xì)胞的結(jié)果，為實(shí)驗(yàn)組；3、4列為GCRV核心感染CIK細(xì)胞的結(jié)果，為陰性對(duì)照組；
[0030]B行1、2列為N-GCRV感染CIK細(xì)胞的結(jié)果，為陽(yáng)性對(duì)照組；3、4列為VP5和VP7的細(xì)胞裂解液上清感染CIK細(xì)胞的結(jié)果，為陰性對(duì)照組。
[0031]從圖中可以看出R-GCRV及N-GCRV感染CIK貼壁細(xì)胞后，培養(yǎng)皿底部出現(xiàn)了很多明顯的分布均勻的空斑或空洞(圖A，B;1、2列)，表明R-GCRV感染CIK細(xì)胞后，病毒可以在敏感細(xì)胞中復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞裂解產(chǎn)生空斑。這一感染特征與N-GCRV —樣。而圖中A行、B行的3、4列為采用GCRV核心及表達(dá)VP5和VP7的細(xì)胞裂解液上清感染CIK細(xì)胞，無(wú)空洞產(chǎn)生，表明細(xì)胞未能受到感染。
【具體實(shí)施方式】
[0032]本發(fā)明提供的體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒制備方法，是在已實(shí)現(xiàn)了利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)GCRV外衣殼蛋白VP5和VP7基礎(chǔ)上進(jìn)行的(專利號(hào):200710168642.2)。采用表達(dá)的外衣殼蛋白VP5和VP7與純化的GCRV核心進(jìn)行體外組裝，由此獲得具有感染性的重組病毒顆粒。此方法可用于研宄外衣殼蛋白VP5和VP7在GCRV侵染宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用，從而揭示GCRV侵染的分子機(jī)制。
[0033]本發(fā)明提供的上述體外組裝草魚(yú)呼腸孤病毒制備方法，包括以下步驟:
[0034](I)采用CIK細(xì)胞(草魚(yú)腎細(xì)胞系)進(jìn)行病毒增殖，獲得大量感染CIK細(xì)胞的草魚(yú)呼腸孤病毒湖南邵陽(yáng)株GCRV873的病毒懸液；
[0035](2)通過(guò)離心法，對(duì)感染了 GCRV873的細(xì)胞病毒懸液進(jìn)行濃縮和純化；
[0036](3)采用胰蛋白酶處理純化的病毒，使完整病毒外衣殼蛋白VP5和VP7完全降解，形成含有核酸的病毒核心顆粒，通過(guò)25-55% (w/v)CsCl密度梯度離心純化，在50% CsCl梯度溶液中得到大量的病毒核心顆粒；
[0037](4)采用重組桿狀病毒vAcGCRV-VP5/VP7感染Sf9細(xì)胞，大量表達(dá)外衣殼蛋白VP5和 VP7 ；
[0038](5)將 vAcGCRV-VP5/VP7 感染的 Sf9 細(xì)胞經(jīng) _80°C及 37°C反復(fù)凍融 3 次，4000g 離心15min沉淀細(xì)胞碎片；
[0039](6)將純化的病毒核心與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)的外衣殼蛋白VP5和VP7細(xì)胞裂解液上清按照不同化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行混合孵育，28°C孵育3h，完成體外組裝；
[0040](7)采用30-50% (w/v)CsCl密度梯度離心純化，在大約40% CsCl梯度中得到大量純化的R-GCRV顆粒；
[0041](8)采用電鏡技術(shù)，SDS-PAGE及空斑測(cè)定，進(jìn)行R-GCRV形態(tài)結(jié)構(gòu)、蛋白組分及感染性分析。結(jié)果表明，R-GCRV與N-GCRV在形態(tài)結(jié)構(gòu)、蛋白組分和感染性等方面極為相似。
[0042]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)上述制備方法作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0043]一.GCRV873的增殖及核心制備
[0044]采用CIK細(xì)胞(草魚(yú)腎細(xì)胞系)進(jìn)行GCRV873增殖。
[0045]1.CIK細(xì)胞培養(yǎng):
[0046]細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的Eagle’s MEM培養(yǎng)基(MEM-10, Invitrogen公司產(chǎn)品)，PH 7.2。取液氮中保存的CIK細(xì)胞，37°C溫育融化。在臺(tái)式離心機(jī)上以5000g離心Imin后轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司產(chǎn)品)中，加5mL的MEM-10培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。CIK細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度為28 °C，待細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底后，采用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0047]2.GCRV873 的增殖:
[0048]傳代的CIK細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)進(jìn)行接毒，首先用10mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered salient,簡(jiǎn)稱PBS)將預(yù)接種的CIK細(xì)胞沖洗2-3次，以除去牛血清蛋白組分；然后將GCRV懸液用無(wú)血清的MEM稀釋后，按照病毒的感染復(fù)數(shù)MOI (Multiplicity of infect1n)約為lPFU/cell加入適當(dāng)培養(yǎng)體積的病毒懸液至單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，吸附細(xì)胞30min后倒掉上清液，再用lOmmol/L PBS清洗細(xì)胞2_3次，去除未吸附的病毒粒子。隨后加入約1/10細(xì)胞瓶體積的含2%胎牛血清的MEM(MEM-2)維持液進(jìn)行病毒增殖。待85%左右的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE)后，收集病毒懸液，于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0049]3.GCRV873 的純化:
[0050]將4°C保存的病毒懸液，以3800g低速離心30min，除去游離的細(xì)胞碎片。將除去細(xì)胞碎片的病毒懸液置超速離心機(jī)(Beckman公司產(chǎn)品)以100，OOOg超速離心2h,沉淀GCRV873顆粒。棄上清液，沉淀按1:250倍體積溶于10臟01/1 PBS中。隨后在臺(tái)式離心機(jī)上再以12，OOOg高速離心5min，除去殘余的細(xì)胞碎片。
[0051]4.GCRV